Μελέτη της αποσιώπησης των εξωνίων 5 και 6 του ανθρώπινου γονιδίου IGF-1 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές

Abstract

Purpose: To determine if the IGF-1 Ea, Eb, Ec peptides, which result from alternative splicing and post-translational modification of the IGF-1 gene, possess biological significance for the cell, aside from that of the mature IGF-1 peptide, which is currently considered the basic biologically active molecule resulting from the IGF-1 gene. Having that in mind, a methodology was assembled to deactivate exons 5 and 6 of the IGF-1 gene, which will lead to the cessation of Ea, Eb, Ec peptide production, while leaving mature IGF-1 unaffected.Methods: A plasmid construct was produced, to replace exon 5 with an antibiotic sequence and introduce stop codons in all reading frames before exon 6, through homologous recombination. The plasmid construct was transfected in PC-3 prostate cancer cells, and the proper antibiotic selections took place. Afterwards, the newly modified cell line was characterized, and emphasis was given to characteristics that differed from the wild type PC-3 cells.Results: The PC-3 cells that successfully received the plasmid construct (EDOKO PC-E CELLS) displayed lowered mobility and proliferation rate, while their size was increased. They also displayed G2/M cell cycle arrest, total loss of the cdc25b factor and senescence. However, when EDOKO PC-3 cells were inserted subcutaneously in SCID mice for 5 weeks, they displayed greater tumorigenic capabilities than the MOCK PC-3 cells, which were transfected with a non-modified plasmid construct, as control samples. These results indicate that the Ea, Eb and Ec peptides possess biological significance for the cell.

Σκοπός: Να διερευνηθεί εάν τα τελικά πεπτίδια Ea, Eb, Ec του παράγοντα IGF-1, τα οποία αποτελούν αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος του γονιδίου του IGF-1 και μετα-μεταφραστικής τροποποίησης, διαθέτουν βιολογική σημασία για το κύτταρο πέρα από τον ώριμο IGF-1, ο οποίος μέχρι τώρα θεωρείται το βασικό βιολογικά ενεργό μόριο το οποίο προέρχεται από το γονίδιο του IGF-1. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκε μεθοδολογία προς απενεργοποίηση των εξωνίων 5 και 6 του γονιδίου του IGF-1, η οποία θα οδηγήσει σε παύση της παραγωγής των τριών πεπτιδίων, αφήνοντας τον ώριμο IGF-1 ανέπαφο.Μεθοδολογία: Κατασκευάστηκε πλασμιδιακός φορέας, ο οποίος μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού θα αντικαταστήσει το εξώνιο 5 με αντιβιοτική αλληλουχία και θα εισάγει κωδικόνια λήξης σε όλα τα πλαίσια ανάγνωσης πριν το εξώνιο 6. Ο φορέας εισάχθηκε σε καρκινικά κύτταρα προστάτη PC-3, και έγιναν οι κατάλληλες αντιβιοτικές επιλογές. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός της νέας κυτταρικής σειράς και εμβάθυνση σε χαρακτηριστικά τους, τα οποία διαφέρουν από τα φυσιολογικά PC-3 κύτταρα.Αποτελέσματα: Τα PC-3 κύτταρα στα οποία εισάχθηκε επιτυχώς ο πλασμιδιακός φορέας (EDOKO PC-3 κύτταρα) παρουσίασαν μειωμένη κινητικότητα, ρυθμό πολλαπλασιασμού, και αυξημένο μέγεθος. Επίσης παρουσίασαν άρση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2/M, ολική απώλεια του παράγοντα cdc25b και πρόωρη κυτταρική γήρανση. Όταν τα EDOKO PC-3 κύτταρα εισάχθηκαν υποδορίως όμως σε SCID ποντίκια για διάστημα 5 εβδομάδων, παρουσίασαν μεγαλύτερη ογκοπαραγωγική ικανότητα από τα MOCK PC-3 κύτταρα, στα οποία είχε εισαχθεί μη τροποποιημένος πλασμιδιακός φορέας ως μάρτυρας. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν ενδείξεις ότι τα πεπτίδια Ea, Eb, Ec διαθέτουν σημαντικούς βιολογικούς ρόλους στο κύτταρο.