Μεθυλίωση της κυτοσίνης στην κωδική περιοχή και θέσεις ματίσματος του p53: συσχέτιση με μεταβολές του ματίσματος κατά την καρκινογένεση

Abstract

The dynamic process of DNA methylation and its catalytic involvement in the development, differentiation and pathological situations such as carcinogenicity has now been established. In contrast to promoters’ methylation, the role of methylation in the coding region of the genes, which is also a dynamic process, remains unclear. Most studies on the effect of intragenic methylation are mainly located in CpG islands. However, the existence of methylation in non-CpG sequences that are often targets of increased genetic instability has attracted the increasing interest during the past few years.Recently, evidence suggested that a key role in the selection of the areas to be expressed on a gene, therefore being spliced, plays the intragenic methylation of the cell. One possible cause for the disorder of splicing could be the disruption in the methylation pattern. P53 is the most important tumour suppressor gene, and its integrity and regulation have a catalytic effect on carcinogenesis. The discovery of the multiplicity of p53 isoforms has greatly contributed to the understanding of the mechanism of action of p53 and could be used in both diagnostically and therapeutically applications. For these reasons, the investigation of alternative splicing in p53 is particularly crucial. This study aims to determine the intragenic pattern of p53 methylation and its correlation with the alternative splicing as well as with any expression of various RNA isoforms in non-small cell lung cancer. For this purpose, we analyzed the methylation pattern at CpG sites (exon 10) and at positions outside CpG sequences (exon 5) and the expression of 3-11 exons of p53 in non-small cell lung cancer. Also, the presence of the complete protein p53, of isoforms Δ133p53, and of p53β and p53γ that derive from alternative splicing in exon 9, was investigated by immunoblotting. Finally, the expression of the two major known genes that act as modulators in the path of p53 in regulating the process of apoptosis and cell cycle, MDM2 and p21, respectively was recorded.The study of the distribution of the methylation and expression pattern of p53 gene in non-small cell lung carcinoma enabled us to collect information on the importance of essential mechanisms of intragenic methylation and alternative splicing, to identify the presence of non-CpG methylation near the activation site of the isoform expressed primarily in the tissue cancer (Δ133p53) and correlate its presence with the existence of informal RNA transcripts. On the contrary, the sites that were examined at the 3΄ end of the gene (exons 9 and 10) showed no variation in the expression between the cancerous and non-cancerous tissue and any differentiation in the methylation pattern. Any disturbance in p53 expression and the production of incomplete transcripts as a result of alternative splicing or internal promoter activation and possible correlation with the methylation stressed the importance of the p53 isoforms function and therefore their relationship with apoptosis and ability to enhance the selection process of oncogenesis.

Η δυναμική διεργασία της μεθυλίωσης του DNA και η καταλυτική συμμετοχή της στην εξέλιξη, τη διαφοροποίηση αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως η καρκινογένεση έχει πλέον τεκμηριωθεί. Σε αντίθεση με τη μεθυλίωση των υποκινητών, o ρόλος της μεθυλίωσης στην κωδική περιοχή των γονιδίων που επίσης αποτελεί δυναμική διαδικασία παραμένει ωστόσο ασαφής. Οι περισσότερες μελέτες για την ενδογονιδιακή μεθυλίωση εντοπίζονται κυρίως στις CpG νησίδες, ενώ τα τελευταία χρόνια έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον και η ύπαρξη μεθυλίωσης σε non-CpG αλληλουχίες που αποτελούν συχνά στόχους αυξημένης γενετικής αστάθειας. Πρόσφατα ολοένα αυξάνονται οι ενδείξεις ότι καθοριστικό ρόλο στην επιλογή των περιοχών που εκφράζονται σε κάποιο γονίδιο, δηλαδή που ματίζονται, παίζει η ενδογονιδιακή μεθυλίωση του κυττάρου. Το p53 αποτελεί το σημαντικότερο ογκοκατασταλτικό γονίδιο και η ακεραιότητα αλλά και η ρύθμιση του έχουν καταλυτική επίδραση στην καρκινογένεση. Η ανακάλυψη την πολλαπλότητας των ισομορφών του p53 έχει σε μεγάλο βαθμό συμβάλει στην κατανόηση του μηχανισμού δράσης του και θα μπορούσε να αξιοποιηθεί τόσο από διαγνωστική, όσο και από θεραπευτική άποψη. Για τους λόγους αυτούς η διερεύνηση της έκφρασης εναλλακτικών μορφών ματίσματος στο p53 κρίνεται ιδιαίτερα καθοριστική. Η διατριβή αυτή έχει ως στόχο τον καθορισμό του ενδογονιδιακού πρότυπου μεθυλίωσης στο p53 και τη συσχέτιση του με το εναλλακτικό μάτισμα καθώς και την τυχόν έκφραση διαφόρων RNA ισομορφών σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκε το πρότυπο μεθυλίωσης σε θέσεις CpG (εξόνιο 10) καθώς και σε θέσεις που βρίσκονται εκτός αλληλουχιών CpG (εξόνιο 5) και αναλύθηκε η έκφραση του γονιδίου στα εξόνια 3-11 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Επίσης, διερευνήθηκε με ανοσοαποτύπωση, η παρουσία της πλήρους πρωτεΐνης p53, των ισομορφών της Δ133p53, καθώς και των p53β και p53γ που προέρχονται από εναλλακτική συναρμολόγηση στο εξόνιο 9. Τέλος καταγράφηκε η έκφραση των δύο σημαντικότερων γνωστών γονιδίων που δρουν ως ρυθμιστές στο μονοπάτι του p53 στη ρύθμιση της διαδικασίας της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου, ΜDM2 και p21, αντίστοιχα.Η μελέτη της κατανομής του προτύπου μεθυλίωσης και έκφρασης του γονιδίου p53 στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μας έδωσε τη δυνατότητα να συλλέξουμε πληροφορίες σχετικά με τη σημασία των σημαντικών μηχανισμών της ενδογονιδιακής μεθυλίωσης και του εναλλακτικού ματίσματος, να αποτυπώσουμε την παρουσία non-CpG μεθυλίωσης κοντά στην θέση έναρξης της ισομορφής που εκφράζεται κυρίως στον καρκίνο ιστό (Δ133p53) και να συσχετίσουμε την παρουσία της με την ύπαρξη άτυπων μεταγραφών RNA. Σε αντίθεση, οι περιοχές που εξετάστηκαν στο 3΄ άκρο του γονιδίου (εξόνια 9 και 10) δεν εμφάνισαν διαφοροποίηση στην έκφραση μεταξύ του καρκινικού και του μη καρκινικού ιστού ούτε διαφοροποίηση στο πρότυπο μεθυλίωσης Η διαταραχή της έκφρασης του p53 και η παραγωγή ελλιπών μεταγράφων ως αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος ή ενεργοποίησης εσωτερικού υποκινητή και η πιθανή συσχέτιση με τη μεθυλίωση τόνισε τη σημασία των ισομορφών στη λειτουργία του p53 και συνεπώς τη σχέση τους με την απόπτωση και αποτελούν γεγονότα που πιθανόν ενισχύουν τη διαδικασία της επιλογής για την ογκογένεση.