Παθολογοανατομική μελέτη της σαρκοπτικής ψώρας στις αίγες

Abstract

Sarcoptic mange of goats is caused by the mite Sarcoptes scabiei var. caprae and is one of the most important ectoparasitic diseases of goats in Greece. Although the clinical and pathological aspects of scabies have been well described in humans and various animal species, cutaneous pathology of the disease in goats has not been studied in detail. The aim of our research was to study the dermatopathology and moreover to assess the cellular immune response and the expression of various cytokeratins in skin lesions of naturally and experimentally infested goats with sarcoptic mange, using histopathological and immunohistochemical techniques. Materials and Methods: Selected cases of 40 goats (23 kids/ 17 goats), from 4 herds, naturally infested by sarcoptic mange were studied. Multiple superficial skin scrapings confirmed the diagnosis. 6 mm punch biopsies were taken under local anesthesia, from lesional areas of the skin. In addition, skin biopsies of 10 healthy goats of 5 different body regions were studied. Human skin biopsies were also used as controls for the immunohistochemistry. For the experimental study, six kids (2-3 months old) and 6 adult goats (1-3 years old) were experimentally infested at the face and the back with 50–100 mites of Sarcoptes scabiei var caprae. Four animals (2 kids and 2 goats) were used as controls. Skin biopsies were taken under local anesthesia from the developing lesions on d2, d4, d8, d12, d18, d25, d33, d40, d50, d60, d75 and d90 respectively. Each tissue sample was cut into two pieces with a sterile scalpel. One half was fixed in 10% formalin whereas the second half was fixed in a non-aldehyde zinc salts fixative. Samples were then embedded in paraffin and processed routinely (stained with Hematoxylin/Eosin and Giemsa), while serial sections from each block were incubated with monoclonal antibodies against T-cell subpopulations (CD3, CD4, CD8, γδ), B cells (CD21), dendritic cells (CD1b), macrophages (CD68) and various cytokeratins. In particular, the immunohistochemical expression of three broad-spectrum cytokeratin markers, AE1-AE3 (for cytokeratins 1-8, 10, 13-16 and 19), MNF-116 (for cytokeratins 5, 6, 8, 17, 19) and 34BE12 (for cytokeratins 1, 5, 10, and 14) and of cytokeratins CK5/6, CK7, CK14 and CK19 was evaluated. Results: The immunohistochemical study of normal skin (kids and goats) did not reveal the presence of any lymphocyte subpopulations in the epidermis, whereas in the dermis T-lymphocytes (CD3+) and their subsets (CD4+, CD8+, WC-1+ γδ), dendritic cells (CD1+) and macrophages (CD68+) were observed, especially perivascularly, while no (CD21+) B-lymphocytes were detected. In normal caprine skin, cytokeratins AE1/AE3 and 34BE12 are expressed in all layers of the epidermis. Cytokeratin MNF116 is expressed in the basal and the spinous layer whereas cytokeratins 5/6, 14 and 19 are confined to the basal layer of the epidermis. The epithelium of the sweat glands is stained by cytokeratins AE1/AE3, MNF116, 34BE12 and CK7 while myoepithelial cells of sweat glands express cytokeratin 5/6. Cytokeratins AE1/AE3 and 5/6 are located in the outer and inner sheath of hair follicles, whereas the outer sheath of hair follicles also expresses MNF116, 34BE12, CK14 and CK19. Sebaceous gland cells are stained by cytokeratins AE1/AE3, MNF116, 34BE12, CK5/6, CK14 and CK19.In naturally and experimentally infested goats, macroscopic lesions included alopecia, pustules, thick crusting and fissures. Histopathological lesions of the skin included orthokeratotic and parakeratotic hyperkeratosis, spongiosis, crusting, subcorneal and intraepidermal pustules, presence of various stages of the parasite (from few to numerous) and hypergranulosis. Epidermal hyperplasia, with acanthosis or pronounced rete ridge formation was present in many biopsies. The study of lymphocytic infiltrate in the dermis of naturally infested goats showed a predominance of the CD3+ lymphocytic population while CD21+ cells were sparse. The inflammatory patterns were mainly perivascular and less frequently dermoepidermal or diffuse. In dermal infiltrate, a predominance of CD4+ over CD8+ T cells was observed. The CD4/CD8 ratio of lesional skin was 4.03±1.54/1. The γδ+ lymphocytes were expressed significantly. Numerous cells expressing CD1b+ and CD68+ cells were found both in superficial and deep dermis, especially perivascular. In epidermis, exocytosis of numerous CD3+, γδ+ T lymphocytes and fewer CD8+ was observed, especially in areas around mites.In experimentally infested goats, an intense immunoinflammatory response dominated by a substantial infiltrate of lymphocytes, accompanied by eosinophils, was recorded from 2nd day post infestation to the completion of the experiment. Immunohistochemistry indicated that by 2nd day, numbers of CD3+, CD8+ and γδ+ in epidermis had increased significantly compared to controls (p<0.05). Moreover, there was an increased exocytosis of CD3+, CD8+, and γδ T cells located in areas with Sarcoptes scabiei compared to areas without mites. In the dermis, a progressive increase of CD3+, CD4+, γδ+ T-lymphocytes was gradually observed until d90, compared to controls (p<0.05). The predominant cells in the inflammatory infiltrate were in all cases CD4+ T cells. Especially in early days of experimental infestation, the CD8+ T-lymphocytes increased significantly. The distribution of all lymphocyte subpopulations in dermis was initially perivascular and throughout the course of time became more diffuse. In dermis, the CD4+/CD8+ ratio gradually changed from 1.92±0.53 at 2nd day post infestation to 4.09 ± 1.88 at the 90th day of experiment. It should be noted that in the dermis of kids, γδ+ cells increased significantly (p <0.005) in comparison to goats from the 12th to the 90th day post infestation. The skin immune response, in both kids and adult goats, was similar in the two areas of infection (face, back), since a statistically significant difference in the number of lymphocytes during infection, was not reported in those areas (p>0,005). Furthermore, CD21+ cells were absent. In scabietic skin of naturally and experimentally infested goats, as the degree of epidermal hyperplasia increased, there was an altered expression of CKMNF116, CK5/6, CK19, CK14 in most layers of the suprabasal epithelium. No difference was observed in immunostaining of CKAE1/AE3, CK34BE12 and CK7 keratins. Discussion: The findings of this study emphasize that mange infestation stimulates the upregulation of T-lymphocyte subpopulations and antigen-presenting cells at lesional skin. Mites and their derived products cause early recruitment and substantial activation of different T-lymphocyte subpopulations (CD4+, CD8+ and γδ+ cells) in the skin. Especially, the γδ+ T cells respond, by proliferation during early and chronic phases of infestation, in an age dependent manner. The high counts of γδ+ T lymphocytes in kids compared to adult goats, suggests that the skin immune system of young animals relies additionally on γδ+ lymphocytes as the parasitic infestation progresses. The altered expression of some cytokeratins in scabietic lesions reflects the occurrence of modifications in the differentiation of keratinocytes correlated with the observed epidermal hyperplasia. Moreover, this study establishes the value of a panel of anti-human keratin monoclonal antibodies cross-reacting with the caprine skin, which can be applied to routine dermatohistopathology of goats. The expression of cytokeratins can be valuable for the study of epithelial differentiation and the characterization of lesions in other goat skin diseases.

Η σαρκοπτική ψώρα στις αίγες προκαλείται από το παράσιτο Sarcoptes scabiei var. caprae και αποτελεί μια από τις πιο σημαντικές εξωπαρασιτώσεις των αιγών στην Ελλάδα. Αν και οι κλινικές και παθολογοανατομικές πτυχές του νοσήματος έχουν περιγραφεί λεπτομερώς στον άνθρωπο και σε διάφορα θηλαστικά, το ίδιο δεν ισχύει και για τις αίγες. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η παθολογοανατομική μελέτη της σαρκοπτικής ψώρας στις αίγες και ειδικότερα, η αξιολόγηση της κυτταρικής ανοσολογικής απόκρισης στο δέρμα και της έκφρασης ποικίλων κυτοκερατινών, τόσο σε φυσικά περιστατικά σαρκοπτικής ψώρας σε εκτροφές όσο και μετά από πειραματική μόλυνση, με τη χρήση ιστοπαθολογικών και ανοσοϊστοχημικών μεθόδων. Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά μελετήθηκαν 40 περιπτώσεις φυσικών περιστατικών αιγών με σαρκοπτική ψώρα (23 ερίφια και 17 αίγες) από 4 εκτροφές. Έγινε λήψη πολλαπλών ξεσμάτων δέρματος για την επιβεβαίωση της διάγνωσηςκαι στη συνέχεια, λήφθηκαν 6 mm punch βιοψίες από τις δερματικές αλλοιώσεις, υπό τοπική αναισθησία. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν οι βιοψίες δέρματος 5 διαφορετικών ανατομικών περιοχών από 10 υγιείς αίγες. Βιοψίες δέρματος ανθρώπου χρησιμοποιήθηκαν συγκριτικά επίσης ως μάρτυρες κατά τη χρήση ανοσοϊστοχημικών μεθόδων. Για την πειραματική μόλυνση, 6 απογαλακτισθέντα ερίφια (2-3 μηνών) και 6 ενήλικες αίγες (1-3 ετών), μολύνθηκαν στο επιρρίνιο και τη ράχη με το στέλεχος Sarcoptes scabiei var caprae (150-200 ακάρεα/ μολύνουσα δόση). Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 4 υγιή ζώα (2 ερίφια και 2 αίγες). Η λήψη των βιοψιών δέρματος από τις αναπτυσσόμενες αλλοιώσεις πραγματοποιήθηκε στις ημέρες d2, d4, d8, d12, d18, d25, d33, d40, d50, d60, d75 και d90 μετά την μόλυνση. Το ήμισυ του βιοπτικού υλικού μονιμοποιήθηκε σε ουδέτερο ρυθμιστικό φορμόλης 10%, ενώ το δεύτερο ήμισυ ιστοτεμάχιο μονιμοποιήθηκε σε διάλυμα αλάτων ψευδαργύρου. Τα δείγματα στη συνέχεια εγκλείστηκαν σε παραφίνη και μελετήθηκαν ιστολογικά (χρώσης ηωσίνης/ αιματοξυλίνης και Giemsa), ενώ για την ανοσοϊστοχημική μελέτη διαδοχικές τομές επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των Τ λεμφοκυτταρικών πληθυσμών (CD3, CD4, CD8, γδ), Β κυττάρων (CD21), δενδριτικών κύτταρων (CD1b), μακροφάγων (CD68) και διάφορων κυτοκερατινών. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η ανοσοϊστοχημική έκφραση τριών δεικτών κυτοκερατινών ευρέος φάσματος, AE1-AE3 (για τις κυτοκερατίνες 1-8, 10, 13-16 και 19), MNF-116 (για τις κυτοκερατίνες 5, 6, 8, 17, 19) και 34BE12 (για τις κυτοκερατίνες 1, 5, 10, και 14) και τις κυτοκερατίνες CK5/6, CK7, CK14 και CK19.Αποτελέσματα: Η ανοσοϊστοχημική μελέτη στο φυσιολογικό δέρμα των εριφίων και αιγών δεν αποκάλυψε την παρουσία κανενός υποπληθυσμού λεμφοκυττάρων στην επιδερμίδα, ενώ στο χόριο του υγιούς δέρματος παρατηρήθηκαν Τ-λεμφοκύτταρα (CD3+) και οι υποπληθυσμοί τους (CD4+, CD8+, WC1+ γδ), δενδριτικά κύτταρα (CD1+) και μακροφάγα (CD68+) κυρίως περιαγγειακά, ενώ δεν παρατηρήθηκαν Β-λεμφοκύτταρα (CD21+). Στο υγιές δέρμα των αιγών, οι κυτοκερατίνες AE1/AE3 και 34BE12 εκφράζονται σε όλες τις στιβάδες της επιδερμίδας. Η κυτοκερατίνη MNF116 εκφράζεται στη βασική και στην ακανθωτή στιβάδα, ενώ οι κερατίνες 5/6, 14 και 19 εκφράζονται στη βασική στιβάδα. Το επιθήλιο των ιδρωτοποιών αδένων είναι θετικό για τις κυτοκερατίνες AE1/AE3, MNF116, 34BE12 και CK7 ενώ τα μυοεπιιθηλιακά κύτταρα των ιδρωτοποιών αδένων εκφράζουν την κυτοκερατίνη 5/6. Οι κυτοκερατίνες AE1/AE3 και 5/6 εντοπίζονται τόσο στον εσωτερικό όσο και στον εξωτερικό κολεό του θυλάκου της τρίχας, ο οποίος επιπλέον εκφράζει τις κυτοκερατίνες MNF116, 34BE12, CK14 και CK19. Οι σμηγματογόνοι αδένες παρουσιάζουν θετική ανοσοχρώση για τις κερατίνες AE1/AE3, MNF116, 34BE12, CK5/6, CK14 και CK19.Οι μακροσκοπικές αλλοιώσεις τόσο των φυσικών όσο και των πειραματικών περιστατικών σαρκοπτικής ψώρας, περιελάμβαναν αλωπεκία, φλύκταινες, υπερκεράτωση, λειχηνοποίηση, ενώ ορισμένα ζώα εμφάνιζαν ρωγμές. Οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις περιελάμβαναν ορθοκερατωτική και παρακερατωτική υπερκεράτωση, σπογγίωση, εφελκιδοποίηση, υποκεράτινες και ενδοεπιδερμιδικές μικροφλύκταινες, παρουσία παρασίτων σε διάφορα στάδια του βιολογικού κύκλου (λίγα έως πολυάριθμα) και υπερκόκκωση. Η επιδερμιδική υπερπλασία με ακάνθωση και το σχηματισμό επιδερμιδικών καταδύσεων ήταν παρούσα σε πολλές βιοψίες. Στα φυσικά περιστατικά, τα ευρήματα της μελέτης του φλεγμονώδους διηθήματος στο χόριο των αιγών αφορούσαν κυρίαρχη έκφραση των CD3+ Τ-λεμφοκυττάρων, ενώ τα CD21+ ανιχνεύτηκαν σπάνια. Το φλεγμονώδες πρότυπο κατανομής ήταν κυρίως περιαγγειακό και λιγότερα συχνά δερμοεπιδερμιδικό ή διάχυτο. Στο φλεγμονώδες διήθημα του χορίου, παρατηρήθηκε κυριαρχία των CD4+ σε σχέση με τα CD8+ T κύτταρα. Η αναλογία CD4/CD8 ήταν 4.03±1.54/1. Τα γδ+ λεμφοκύτταρα εκφράζονταν σε μεγάλο βαθμό. Πολλά κύτταρα που εξέφραζαν CD1b+ και CD68+ εντοπίστηκαν στο επιπολής και εν τω βάθει χόριο, κυρίως περιαγγειακά. Στην επιδερμίδα, παρατηρήθηκε σημαντική εξωκύττωση των CD3+, γδ+ λεμφοκύτταρων και σε μικρότερο βαθμό των CD8+, ειδικά σε περιοχές όπου εντοπίζονταν παράσιτα. Στις αίγες που μολύνθηκαν πειραματικά, η έντονη ανοσολογική απόκριση που χαρακτηρίζονταν από σημαντική λεμφοκυτταρική διήθηση συνοδευόμενη από εωσινόφιλα παρατηρήθηκε από τη δεύτερη ημέρα της μόλυνσης μέχρι την ολοκλήρωση του πειράματος. Η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση έδειξε ότι από την δεύτερη ημέρα της μόλυνσης, οι αριθμοί των CD3+, CD8+ και γδ+ κυττάρων στην επιδερμίδα αυξήθηκαν σημαντικά σε σχέση με τους μάρτυρες (p<0.05). Επιπρόσθετα, αυξημένη εξωκύττωση των CD3+, CD8+ και γδ T κυττάρων εντοπίστηκε σε περιοχές με Sarcoptes scabiei σε σχέση με εκείνες χωρίς τα παράσιτα. Στο χόριο, μια προοδευτική αύξηση των CD3+, CD4+, γδ+ T λεμφοκυττάρων παρατηρήθηκε έως και την 90η ημέρα μετά την πειραματική μόλυνση, σε σχέση με τους μάρτυρες (p<0.05). Τα κύτταρα που κυριαρχούσαν στο φλεγμονώδες διήθημα ήταν σε όλες τις περιπτώσεις CD4+ T κύτταρα. Ειδικά, τα CD8+ T λεμφοκύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά τις πρώτες ημέρες της πειραματικής μόλυνσης,. Η κατανομή όλων των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών ήταν αρχικά περιαγγειακή και κατά τη διάρκεια της μόλυνσης έγινε διάχυτη. Στο χόριο, η αναλογία των CD4+/CD8+ σταδιακά μεταβλήθηκε από 1.92±0.53 την δεύτερη ημέρα της μόλυνσης σε 4.09 ± 1.88 την 90η ημέρα. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι στο χόριο των εριφίων, τα γδ+ κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά (p <0.005) σε σχέση με τις ενήλικες αίγες από την 12η ημέρα έως και την 90η ημέρα μετά την μόλυνση. Η ανοσολογική απόκριση του δέρματος, τόσο στα ερίφια όσο και στις ενήλικες αίγες, ήταν παρόμοια στις δύο περιοχές μόλυνσης (επίρρινιο, ράχη), μιας και δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στον αριθμό των λεμφοκυττάρων κατά τη διάρκεια της μόλυνσης στις περιοχές αυτές (p >0,005). Επιπρόσθετα, δεν ανιχνεύτηκαν CD21+ κύτταρα. Στο δέρμα με σαρκοπτική ψώρα τόσο των φυσικών περιστατικών όσο και εκείνων που προέκυψαν με πειραματική μόλυνση, καθώς ο βαθμός της επιδερμιδικής υπερπλασίας αυξανόταν, παρατηρήθηκε έκφραση των κερατινών CKMNF116, CK5/6, CK19, CK14 σε πολλές κυτταρικές σειρές της ακανθωτής στιβάδας ενώ δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην έκφραση των κερατινών CKAE1/AE3, CK34BE12 και CK7. Συζήτηση: Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης δείχνουν ότι η σαρκοπτική ψώρα διεγείρει την αύξηση της έκφρασης Τ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών και αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων στις βιοψίες δέρματος με αλλοιώσεις. Τα παράσιτα και τα παραγόμενα προϊόντα τους, προκαλούν την ταχεία στρατολόγηση και την ενεργοποίηση των διαφορετικών Τ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (CD4+, CD8+ and γδ+ κύτταρα) στο δέρμα. Ειδικότερα, τα γδ+ T κύτταρα πολλαπλασιάζονται τόσο κατά τη διάρκεια των αρχικών όσο και των χρόνιων σταδίων της νόσου, με τρόπο που εξαρτάται από την ηλικία των αιγών. Οι υψηλοί αριθμοί των γδ+ T λεμφοκυττάρων στα ερίφια, συγκρινόμενοι με των ενήλικων αιγών, υποδεικνύουν ότι το ανοσοποιητικό σύστημα των νεαρότερων ζώων βασίζεται επιπρόσθετα στα γδ+ λεμφοκύτταρα καθώς εξελίσσεται η παρασιτική μόλυνση. Σε ό,τι αφορά στην τροποποιημένη έκφραση ορισμένων κυτοκερατινών στις δερματικές αλλοιώσεις της σαρκοπτικής ψώρας, αυτή αντανακλά την ύπαρξη αλλαγών στον τρόπο διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων και σχετίζεται με την παρατηρούμενη επιδερμιδική υπερπλασία. Η έκφραση διάφορων κερατινών μπορεί να συντελέσει στην μελέτη της επιθηλιακής διαφοροποίησης και στο χαρακτηρισμό αλλοιώσεων του δέρματος της αίγας και σε άλλες δερματοπάθειες. Επιπρόσθετα, η παρούσα μελέτη καθιερώνει την χρήση μιας σειράς μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικότητας ανθρώπου, που παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντίδραση στο δέρμα αιγών, και μπορούν έτσι να εφαρμοστούν στη δερματοιστοπαθολογία των αιγών.