Moριακός χαρακτηρισμός των εντεροενδοκρινών κυττάρων χολοκυστοκινίνης του δωδεκαδακτύλου

Abstract

The enteroendocrine system orchestrates the physiological responses to food intake. Enteroendocrine (EEC) cells sense nutrients and secrete hormones in response to them. There are more than fifteen subtypes of EEC cells that secrete a range of gut hormones, which play a pivotal role in the co-ordination of food digestion, control of appetite and the regulation of glucose homeostasis. I-cells represent a subset of enteroendocrine cells that are mainly localized in the proximal small intestine(duodenum) and release cholecystokinin (CCK) in response to nutrients (mainly fat). CCK is the archetypal satiety hormone that transmits anorectic signals to the brain via a gut-to-brain signalling pathway, mediated by vagal afferent neurons. Additionally,CCK has a key pro-digestive function by inhibiting gastric emptying and stimulating the release of bile from the gallbladder and the secretion of pancreatic enzymes. Until recently, the characterization of enteroendocrine cells has been restricted to cell line models. The development of transgenic animal models with genetically tagged enteroendocrine cells enabled us to study native enteroendocrine cells. We used a transgenic mouse model that express enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) under the control of Cck gene promoter, in order to study native I-cells. Initially, we developed a robust protocol for the isolation of duodenal CCK-containing cells that represent the typical I-cells. By using semi-quantitative RT-PCR, we revealed that duodenal I-cells contain mRNA transcripts encoding key long chain fatty acid (LCFA), short chain fatty acid (SCFA) and endocannabinoid receptors. We also analysed the gut hormone content of duodenal I-cells and found that a subpopulation of CCK-containing cells co-express CCK with proglucagon, glucose-dependent insulinotropic peptide (GIP), Peptide YY (PYY), neurotensin, secretin and surprisingly the orexigenic hormone ghrelin. Our findings suggest that duodenal I-cells have the capacity to sense LCFA, SCFA, fatty acid lipid amides and intestinal endocannabinoid peptides. They also indicate that there is a significant overlap between I-cells and other subsets of EEC cells and that a subset of I-cells may co-release CCK with other gut hormones.

Το εντεροενδοκρινές σύστημα συντονίζει τη φυσιολογική απάντηση του οργανισμού που ακολουθεί την λήψη τροφής. Τα εντεροενδοκρινή κύτταρα αισθάνονται/αναγνωρίζουν τα θρεπτικά συστατικά που βρίσκονται στον εντερικό αυλό και απαντούν σε αυτά τα ερεθίσματα εκκρίνοντας ορμόνες. Υπάρχουν πάνω από 15 τύποι εντεροενδοκρινών κυττάρων που εκκρίνουν μια σειρά από εντερικές ορμόνες, οι οποίες επιτελούν κυριάρχο ρόλο στο συντονισμό της πέψης του φαγητού, στον έλεγχο της όρεξης και στη ρύθμιση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα. Tα I-κύτταρα αποτελούν ένα τύπο εντεροενδοκρινών κυττάρων που κυρίως εντοπίζονται στο εγγύς λεπτό έντερο (δωδεκαδάκτυλο) και εκκρίνουν την ορμόνη χολοκυστοκινίνη όταν διεγείρονται από θρεπτικά συστατικά (κυρίως λίπη). H χολοκυστοκινίνη θεωρείται ως η αρχετυπική ορμόνη που δημιουργεί αίσθημα κορεσμού μετά το φαγητό και διαμεσολαβεί ανορεξικά σήματα από το έντερο προς τον εγκέφαλο, μέσω του πνευμονογαστρικού νεύρου. Επιπλέον, η χολοκυστοκινίνη διευκολύνει την πέψη παρατείνοντας το χρόνο παραμονής της τροφής στο στόμαχο ενώ παράλληλα διεγείρει την απελευθέρωση της χολής από τη χοληδόχο κύστη και την έκκριση των παγκρεατικών ενζύμων. Μέχρι πρόσφατα, οι προσπάθειες για το χαρακτηρισμό των εντεροενδοκρινών κυττάρων περιορίζονταν στην μελέτη κυτταρικών σειρών-μοντέλων. Η ανάπτυξη διαγονιδιακών μοντέλων ζώων με γενετικά σημασμένα εντεροενδοκρινή κύτταρα μας δίνει τη δυνατότητα μελέτης των φυσιολογικών εντεροενδοκρινών κυττάρων. Για την έρευνά μας, χρησιμοποιήσαμε ένα διαγονιδιακό μοντέλο μυός/ποντικού το οποίο εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτείνη eGFP κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου της χολοκυστοκινίνης με σκοπό να μελετήσουμε τα Ι-κύτταρα. Αρχικά, αναπτύξαμε ένα αξιόπιστο πρωτόκολλο για την απομόνωση των κυττάρων χολοκυστοκινίνης του δωδεκαδακτύλου που αποτελούν τον πληθυσμό των τυπικών Ι-κυττάρων. Χρησιμοποιώντας την ημι-ποσοτική μέθοδο RT-PCR, δείξαμε πως τα δωδεκαδακτυλικά Ι-κύτταρα περιέχουν mRNA μετάγραφα τα οποία κωδικοποιούν την έκφραση πρωτεϊνών υποδοχέων των μακράς αλύσου λιπαρών οξέων, κοντής αλύσου λιπαρών οξέων καθώς και ενδοκανναβινοειδών πεπτιδίων. Παράλληλα, αναλύσαμε το ορμονικό περιεχόμενο των δωδεκαδακτυλικών Ι-κυττάρων ανακαλύπτοντας ότι ένας υποπληθυσμός κυττάρων χολοκυστοκινίνης συν-εκφράζει μαζί με τη χολοκυστοκινίνη και άλλες εντερικές ορμόνες όπως η προγλουκαγόνη, το εξαρτώμενο από τη γλυκόζη ινσουλινοτροπικό πεπτίδιο, το πεπτίδιο ΥΥ, η νευροτενσίνη, η εκκριτίνη/σεκριτίνη και παραδόξως η ορμόνη γκρελίνη- η μοναδική από τις εντερικές ορμόνες που διεγείρει την όρεξη για τη λήψη τροφής. Τα ευρήματά μας συνηγορούν στη δυνατότητα των κυττάρων χολοκυστοκινίνης του δωδεκαδακτύλου να αναγνωρίζουν λιπαρά οξέα μακράς και κοντής αλύσου, προιοντα μεταβολισμού των λιπαρών οξέων καθώς και εντερικά ενδοκανναβινοειδή πεπτίδια. Επιπλέον, υποστηρίζουν την θεώρηση πως υπάρχει αλληλοεπικάλυψη ανάμεσα στους διάφορους τύπους των εντεροενδοκρινών κυττάρων και ότι είναι πιθανό ένας υποπληθυσμός των Ι-κυττάρων να εκκρίνει χολοκυστοκινίνη σύγχρονα με άλλες εντερικές ορμόνες.