Γαμετογένεση και μελέτη της ακτίνης 2 στα παράσιτα της ελονοσίας

Abstract

This study focus in the mosquito stages of malaria parasites. The results are presented in four chapters. The first chapter describes the mechanism of gametocyte egress from the host erythrocyte during gametogenesis. Malaria parasites infect erythrocytes and initiate a series of asexual multiplication cycles or they develop into female and male gametocytes. The production of female and male gametes, known as gametogenesis, takes place after uptake by the mosquito. The parasite egress from the host erythrocyte during gametogenesis involving sequential rupture of the membranes of the parasitophorous vacuole (PVM) and erythrocyte (RBCM). We present detailed observations of these events in real time using high-speed video microscopy and immunofluorescence assays. The first sign of egress is swelling of the host cell. The PVM ruptures and vesiculates. This is followed by the opening of a single stabilized pore of the RBCM. The RBCM is subsequently vesiculated, releasing the gametes. In the second chapter we study actin 2, one of the two actin isoforms in malaria parasites. Actin 1 has a vital role in all developmental stages, whereas actin 2 is essential in male gametogenesis. By genetic replacement of actin 2 with actin 1, we show that the two actin isoforms have distinct functions in male gametogenesis and we found an additional essential role of actin 2 in oocyst development. The function of actins depends on the polymerization properties. In the third chapter, replacement of actin 2 by chimeric actin 1 revealed that polymerization of actin 2 is necessary in gametogenesis but is not enough for the oocyst development. In the fourth chapter, global expression profiling reveals shared and distinct transcript signatures in arrested act2(-) and CDPK4(-) gametocytes.

Η διατριβή έχει ως σκοπό την μελέτη των σταδίων του παράσιτου της ελονοσίας που λαμβάνουν χώρα στο κουνούπι. Τα αποτελέσματα χωρίζονται σε τέσσερα κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο μελετήσαμε τον μηχανισμό της έξοδου του παρασίτου από το κύτταρο ξενιστή κατά την γαμετογένεση. Τα παράσιτα εισβάλουν στα ερυθροκύτταρα του αίματος και αρχίζει ένας κύκλος από μη φυλετικά στάδια, ενώ κάποια θα διαφοροποιηθούν σε αρσενικά και θηλυκά γαμετοκύτταρα. Με την είσοδο των παρασίτων στο κουνούπι ξεκινάει η γαμετογένεσης, δηλαδή η δημιουργία αρσενικών και θηλυκών γαμετών. Κρίσιμο σημείο στην γαμετογένεση αποτελεί η έξοδος του παρασίτου από το ερυθροκύτταρο, με την ρήξη των δύο μεμβρανών που περιβάλλουν το παράσιτο, την μεμβράνη του παρασιτοφόρου κενοτοπίου (PVM) και την μεμβράνη του ερυθροκυττάρου (RBCM). Με την καταγραφή της εξόδου των παρασίτων σε πραγματικό χρόνο και με την μέθοδο του ανοσοφθορισμού αποκαλύψαμε τέσσερις διακριτές φάσεις. Αρχικά το ερυθροκύτταρο διογκώνεται, η PVM διαρρηγνύεται και σχηματίζει κυστίδια, ένας μοναδικός πόρος ανοίγει στην RBCM και ακολουθεί η ρήξη της RBCM και ο σχηματισμός κυστιδίων από αυτήν. Το δεύτερο κεφάλαιο έχει ως θέμα τη λειτουργία της ακτίνης 2, της δεύτερης ισομορφής ακτίνης του παρασίτου. Η ακτίνη 1 είναι απαραίτητη για όλα τα στάδια του κύκλου ζωής ενώ η ακτίνη 2 είναι απαραίτητη για την γαμετογένεση των αρσενικών. Με την γενετική αντικατάσταση της ακτίνης 2 με την ακτίνη 1 δείξαμε ότι οι δύο ισομορφές έχουν ξεχωριστές λειτουργίες στην γαμετογένεση και αποκαλύψαμε ένα δεύτερο κρίσιμο ρόλο της ακτίνης 2 στην ανάπτυξη των ωοκυστών στο έντερο του κουνουπιού. Ο πολυμερισμός της ακτίνης είναι σημαντικός για την λειτουργία της. Στο τρίτο κεφάλαιο των αποτελεσμάτων, η αντικατάσταση της ακτίνης 2 με χιμαιρικές μορφές της ακτίνης 1 έδειξε ότι ο πολυμερισμός της ακτίνης 2 είναι απαραίτητος για την γαμετογένεση των αρσενικών αλλά δεν αρκεί για την ανάπτυξη των ωοκυστών. Στο τέταρτο κεφάλαιο των αποτελεσμάτων με μικροσυστοιχίες γονιδίων πήραμε το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης σε γαμετοκύτταρα όπου απουσιάζει είτε η ακτίνη 2 είτε η ασβεστο-εξαρτώμενη κινάση 4 (CDPK4). Βρέθηκε ένας σημαντικός αριθμός κοινών και διαφορετικών γονιδίων με διαφορά στην έκφραση στα δύο μεταλλάγματα.