Υπερέκφραση / αποσιώπηση του MGF σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού: ο ρόλος του MGF στην βιολογία του καρκίνου του μαστού

Abstract

Introduction: Although the Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) is a point of convergence for major signaling pathways implicated in breast cancer biology, the potential roles of the distinct IGF-1 isoforms in human malignancies are largely unknown. The Carboxyl (C-) terminal Ec peptide (24aa) of the IGF-1Ec variant has been suggested to have a distinct role in several pathophysiological conditions including prostate cancer and osteosarcoma. Herein, we investigated the possible role of Ec peptide in human breast cancer using in vitro models.Materials and Methods: Human breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cells were treated with synthetic peptides corresponding to human and mouse Ec peptides, mature human IGF-1 and scramble Ec peptide (negative control). In addition, the C-terminal Ec domain of the IGF-1Ec isoform was cloned into a vector containing the CMV promoter (pIRES2-EGFP) and transfected MCF-7 cells until generation of stable clones over-expressing the Ec peptide (MCF-7 Ec cells). Using MTT and trypan blue exclusion assays along with flow cytometry (cell cycle) and immunocytochemistry for ki67 staining we compared the proliferation rates of MCF-7 Ec cells, mock transfectants (mock MCF-7 cells) and wild type MCF-7 cells (wt MCF-7 cells). Furthermore, we investigated the migratory capacities using the wound healing/scratch assay. Apoptosis/Necrosis rates in response to Docetaxel were also examined using flow cytometry and Annexin/PI staining. Expression patterns of steroid receptors, Cadherins and both ERK and AKT signaling pathways were estimated using real time qPCR and WB analysis.Results : Exogenous human, but not mouse, Ec peptide (from 3.125 up to 100nM) stimulated [up to 42% (p<0.02) at 12.5nM, 48h] the proliferation rate of MCF-7 cells (and not MDA-MB-231 cells). While mock MCF-7 cells were phenotypically identical to wt cells, stable transfected MCF-7 Ec cells acquired a spindle-like phenotype and possessed an increased rate of proliferation [maximum effect 50% (p<0.05), 48 h], compared to mock MCF-7 and wt MCF-7 cells. Metabolic activity of the MCF-7 Ec transfectants, relative to mock MCF-7 and wt MCF-7 cells, was upregulated [maximum effect 40% (p<0.03), 24 h), whereas the distribution of MCF-7 Ec cells into the S phase of the cell cycle was marginally increased (by 10%, 24h). Furthermore, the migratory potential of the MCF-7 Ec transfectants was significantly increased [by 37% (p<0.002), 16h], whereas the rates of late apoptosis and necrosis of MCF-7 Ec cells in response to Docetaxel were slightly decreased (by 10%, 48h) as compared to mock MCF-7 and wt MCF-7 cells. Protein levels of ERα along with mRNA levels of Cdh-11 were upregulated by approximately 2.2 folds, while phosphorylation of ERK1/2 was increased by 2.41 times in MCF-7 Ec. Conclusion: Our results indicate that Ec domain of IGF-1Ec isoform induces proliferation, migration and survival of ER+ MCF-7 breast cancer cells via ERK1/2 signaling and cross talks with ERα and Cdh-11 and further contribute to the notion for unique bioactivity of Ec peptide in human malignancies. These data suggested that overexpression of the Ec peptide influences the biology of the MCF-7 breast cancer cells, in vitro. Further studies on the role of this isoform may shed light into the complex progression and metastasis of the disease and identify Ec peptide as a potential target candidate in breast cancer therapeutics.

Εισαγωγή : Αν και η σημασία του Ινσουλινο-μιμιτικού αυξητικού παράγοντα-1 (IGF-1) στην βιολογία του καρκίνου του μαστού έχει πολύ καλά περιγραφεί, οι πιθανοί ρόλοι των ισομορφών του IGF-1 στις ανθρώπινες κακοήθειες παραμένουν άγνωστοι. Διάφορες αναφορές κάνουν λόγω για ένα ξεχωριστό ρόλο του καρβοξυτελικού άκρου (24 αμινοξέα στο C-terminal) της IGF-1Ec ισομορφής (γνωστό και ως μηχανό-αυξητικός παράγοντας, MGF), στη βιολογία του καρκίνου του προστάτη και στα οστεοσαρκώματα. Στην παρούσα εργασία ερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο του Ec πεπτιδίου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του μαστού. Υλικά και μέθοδοι : Τα ανθρώπινα MCF-7 και MDA-MB-231 καρκινικά κύτταρα μαστού εκτέθηκαν σε συνθετικά πεπτίδια ώριμου ανθρώπινου IGF-1, ανθρώπινου και ποντικίσιου Εc πεπτιδίου και τυχαίας αλληλουχίας 24 αμινοξέων (αρνητικό κοντρόλ). Επιπλέον η καρβοξυτελική περιοχή 24 αμινοξέων της IGF-1Ec ισομορφής κλωνοποιήθηκε σε φορέα που περιέχει τον υποκινητή του κυτταρομεγαλοιού (pIRES2-EGFP) και διαμόλυνε τα MCF-7 κύτταρα μέχρι την ανάπτυξη κλώνων που υπερεκφράζουν το Ec πεπτίδιο (MCF-7 Ec cells). Το δυναμικό πολλαπλασιασμού των MCF-7 Ec κυττάρων σε σχέση με τα mock MCF-7 και τα πατρικά MCF-7 ελέγχθηκε με τις μεθόδους του MTT, trypan blue, κυτταρομετρία ροής (κυτταρικός κύκλος) και ανοσοκυτταροχημεία (για χρώση της ki67 πρωτεΐνης). Η μεταναστευτικότητα των κυττάρων μετρήθηκε με την τεχνική πρόκλησης / επούλωσης τραύματος, ενώ τα ποσοστά απόπτωσης / νέκρωσης ως απάντηση στην Δοσεταξέλη με κυτταρομετρία ροής και χρώση PI / Ανεξίνης. Τέλος, η έκφραση των υποδοχέων των στεροϊδών ορμονών, των κατχερινών και των σηματοδοτικών μονοπατιών της ERK και ΑΚΤ, αναλύθηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (QPCR) και με ανοσοαποτύπωση. Αποτελέσματα : H εξωγενής χορήγηση ανθρώπινου Εc πεπτιδίου επάγει τον πολλαπλασιασμό των MCF-7 κυττάρων (και όχι των MDA-MB-231) μέχρι και 42% (p<0.02). Τα πειράματα υπερέκφρασης έδειξαν ότι ενώ τα mock MCF-7 κύτταρα ήταν φαινοτυπικά πανομοιότυπα με τα πατρικά, τα σταθερά διαμολυσμένα MCF-7 Ec κύτταρα παρουσίασαν έναν πιο ατρακτοειδή φαινότυπο με μυτερές απολήξεις και κατείχαν αυξημένο δυναμικό πολλαπλασιασμού ( μέχρι και 50% στις 48 h, p<0.05), σε σχέση με τις άλλες κυτταρικές σειρές. Η μεταβολική δραστηριότητα των σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων αυξήθηκε μέχρι και 40% (p<0.03), ενώ μικρή αύξηση παρατηρήθηκε και στην κατανομή των κυττάρων στην S φάση του κυτταρικού κύκλου (10%). Επιπλέον, η μεταναστευτικότητα των MCF-7Ec κυττάρων αυξήθηκε κατά 37% (16h, p<0.002), ενώ τα ποσοστά της απόπτωσης και νέκρωσης μετά από επίδραση Δοσεταξέλης μειώθηκαν κατά περίπου 10% σε σχέση με τα mock και τα πατρικά κύτταρα. Τέλος τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα με φορέα υπερέκφαρσης του Εc πεπτιδίου παρουσίασαν αυξημένη έκφραση του α υποδοχέα των οιστρογόνων (ΕRα), και της μεσεγχυματικής κατχερίνης-11, ενώ και η φοσφορυλίωση του ERK1/2 μονοπατιού (και όχι του ΑΚΤ) αυξήθηκε κατά 2.4 φορές. Συμπεράσματα : Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το καρβοξυτελικό άκρο (24 αμινοξέα) της IGF-1Ec ισομορφής μπορεί να επάγει τον πολλαπλασιασμό, την μετανάστευση και την ανθεκτικότητα των ορμονοεξαρτώμενων MCF-7 κυττάρων μέσω του ERK1/2 μονοπατιού και αλληλεπιδράσεων με τον ERα και την κατχερίνη-11. Η υπερέκφραση του Εc πεπτιδίου φαίνεται να επηρεάζει την βιολογία του καρκίνου του μαστού in vitro. Περαιτέρω μελέτες για τον ρόλο του συγκεκριμένου μορίου ίσως ρίξουν φως στις σύνθετες διαδικασίες εξέλιξης και μετάστασης της νόσου και διασαφηνίσουν αν το Εc πεπτίδιο μπορεί να λειτουργήσει ως πιθανός θεραπευτικός στόχος έναντι του καρκίνου του μαστού.