Βλάβη ισχαιμίας-επαναιμάτωσης στο γαστρεντερικό σύστημα και ο ρόλος του συμπληρώματος

Abstract

PART 1: HOW THE COMPLEMENT AFFECTS THE DEVELOPMENT OF TISSUE DAMAGE IN AUTOIMMUNE PRONE MICE AFTER ISCHEMIA REPERFUSION INJURY. The destruction of tissue damage due to ischemia reperfusion plays an important role in the outcome of many clinical scenarios such as trauma, hemorrhagic shock, organ transplants, hear surgeries and autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE). It is widely known that MRL/lpr mice are susceptible to autoimmune diseases and show an increased tendency of tissue damage by ischemia-reperfusion. Several studies have shown that activation of the complement in the early stages of this destructive pathway leads to tissue damage by an intense inflammatory response. Nonetheless the role of complement during ischemia-reperfusion in mice susceptible to autoimmune diseases has not been clarified.During this study we show that the intestinal destruction is significantly reduced in experimental mice MRL/lpr that had low or no levels of complement factors as a result of the use of Cobra Venom Factor (CVF) compared with the experimental MRL/lpr mice which had adequate levels of complement factors after induced intestinal damage I/R. This protection was directly linked to the reduced deposition of complement factors C3 and C5b-C9 on the intestinal tissues. There was a remarkable reduction in the recruitment of neutrophils to the region of intestinal tissue destruction in experimental MRL/lpr mice with low or no levels of complement factors compared to the experimental MRL/lpr mice that had adequate levels of complement factors. Likewisse, the are was a clear reduction of oxidative stress in the intestine as measured by the activity of the peroxidase dismutase (SDA) and the mRNA transcription levels of glutathione peroxidase (GPX-1). We also observed a marked reduction in mRNA levels of proinflammatory cytokines (IL-1b, IL-6 and TNF-a).Subsequently, we studied the effect of the elimination of complement in the development of remote tissue destruction and particularly to the lungs of experimental MRL/lpr mice. We have shown that the experimental mice that had low or no levels of complement factors had decreased levels of tissue destruction in the lungs compared to the experimental mice that had adequate levels of complement factors after induced intestinal damage I/R. The deposition of complement factor C3 in the pulmonary parenchyma of experimental mice MRL/lpr with elimination of the supplement was reduced. These results confirm that the regulation of activity of complement is capable of protecting the mice susceptible to SLE from tissue damage after injury I/R.Simultaneously in this study we show that the use of receptor inhibitor of C5a, in experimental MRL/lpr mice is able to protect these mice from intestinal tissue destruction after induced intestinal damage I/R. We show a statistically significant improvement of the intestinal histology of experimental MRL/lpr mice receiving the inhibitor and a large reduction in infiltration of neutrophils the small intestine. Nevertheless, the use of C5aRA was unable to protect experimental mice from the remote tissue damage to the lungs, indicating that some other factors involved in the organization of the remote destruction after injury I/R. Indeed, recent studies have shown that platelets can activate complement and vice versa and can modulate the immune response during various conditions such as I/E injury autoimmune diseases.In conclusion, we demonstrated that CVF, is able protect experimental MRL/lpr mice from both the local tissue destruction and remote tissue damage after induced intestinal I/R injury. At the same time we present the beneficial effects of C5aRA in the expression of local tissue destruction in experimental mice after I/R injury. Simultaneously new questions are born regarding the failure of C5aRA to protect the experimental mice from remote tissue damage. Questions we try to answer in the next section.PART 2: THE ROLE OF PLATELET FACTOR 4 IN LOCAL AND REMOTE TISSUE DAMAGE AFTER INTESTINAL ISCHEMIA REPERFUSION INJURY.The contribution of platelets and the proteins they secrete, such as platelet factor 4 (platelet factor 4, PF4), in the pathophysiology of ischemia reperfusion injury has not been yet clarified. In this section, we present a new role of protein PF4 in orchestrating the remote tissue destruction after I/R injury. First, we show that the intestinal epithelial cells appear to produce the protein PF4 in the gut as evidenced by the stains and measurement of levels of mRNA expression of the protein PF4. As we show the Sham group of experimental mice had some PF4 levels of mRNA production which increased significantly during induced intestinal I/R injury. Instead there is no change in the mRNA expression levels of PF4 in the lungs of experimental mice after I/R injury.In order to study the role of PF4 in the expression of tissue damage after I/R injury, we used the transgenic mice PF4 -/- which produces no protein PF4. The transgenic mice PF4 -/-, showed reduced tissue destruction both in the lung and the small intestine. We also confirm the absence of the PF4 protein in all transgenic mice PF4 -/- used in the experiments by measuring the levels of PF4 in plasma. Next, we determined the differences in infiltration of neutrophils and monocytes into the lungs and small intestine of mice after induced I/R injury. We found that the presence of neutrophils has a statistically significant increase in the IR group of experimental B6 mice. In contrast, there were no statistically significant differences in the infiltration of neutrophils in the transgenic mice PF4-/-. We safely assume that the increased presence of platelets and thus the PF4, in regions of the pulmonary vessels as a result of intestinal I/R injury can contribute to creation of a gradient of chemokines controlling the infiltration of monocytes and neutrophils at the side of tissue destruction. Knowing the role of immunoglobulins and complement in the process of tissue destruction after I/R injury, in subsequent experiments, we wanted to measure the levels of immunoglobulins in plasma and deposition of immunoglobulins and complement in tissues of experimental mice. We show that the absence of PF4 from the transgenic mice did not affect neither the deposition of factor C3, and the immunoglobulins IgA and IgM nor the levels of IgM and IgG in plasma of the experimental mice. In contrast, the levels of IgA in the plasma was increased in Sham groups and IR transgenic mice PF4 -/- as compared to the Sham and IR groups of B6 mice.To determine that the PF4 protein derived from platelets is the main regulator of the expression of the remote tissue damage we continued our study with a series of experiments with platelet transfusions. The elimination of platelets in the transfusied PF4 -/- and B6 mice was done by the use of a specific antibody. As we show, the transfusion of PF4-/- platelets in the B6 mice was able to protect the mice from remote tissue damage in the lungs as compared to B6 mice that received B6 platelets. Noteworthy is the fact, that the transfusion of B6 platelets in the platelet free PF4-/- mice, was able to reconstitute both local intestinal tissue damage as well as the remote tissue damage in the lungs of these mice.Our study demonstrates, for the first time the importance of PF4 protein in the expression of tissue damage after I/R injury. Our results clearly show the special role of PF4 in orchestrating the immune response and promote PF4 as a potential therapeutic target for the treatment of tissue damage after I/R injury.

1η ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΕΝΟΤΗΤΑ: ΠΩΣ ΤΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΗΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ΣΕ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΕΠΙΡΡΕΠΗ ΣΕ ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΝΤΕΡΙΚΗ ΒΛΑΒΗ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ. Η καταστροφή του ιστού από την βλάβη λόγω ισχαιμίας επαναιμάτωσης παίζει σημαντικό ρόλο στην έκβαση πολλών κλινικών σεναρίων όπως το τραύμα, το αιμορραγικό σοκ, η μεταμοσχεύσεις οργάνων, η επεμβάσεις επαναιμάτωσης αλλά και τα αυτοάνοσα νοσήματα όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ). Είναι ευρέως γνωστό ότι τα ποντίκια MRL/lpr που είναι επιρρεπή σε αυτοάνοσα παρουσιάζουν αυξημένη τάση ιστικής βλάβης από ισχαιμία επαναιμάτωση. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του συμπληρώματος βρίσκεται στα αρχικά στάδια του καταστροφικού αυτού μονοπατιού που οδηγεί σε ιστική ζημιά μέσω μιας έντονης φλεγμονώδους αντίδρασης. Παρόλα αυτά ο ρόλος του συμπληρώματος κατά την διάρκεια της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης σε ποντίκια επιρρεπή σε αυτοάνοσα νοσήματα δεν έχει ξεκαθαριστεί. Κατά την διάρκεια αυτής της μελέτης παρουσιάζουμε ότι η εντερική καταστροφή είναι στατιστικά σημαντικά μειωμένη σε πειραματικά ποντίκια MRL/lpr που είχαν χαμηλά εως καθόλου επίπεδα παραγόντων συμπληρώματος ως αποτέλεσμα της χρήσης του παράγοντα δηλητηρίου της κόμπρας (Cobra Venom Factor) σε σύγκριση με τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr που είχαν επαρκή επίπεδα παραγόντων συμπληρώματος μετά από επαγόμενη εντερική βλάβη Ι/Ε. Η προστασία αυτή ήταν άμεσα συνδεδεμένη με την μειωμένη εναπόθεση των παραγόντων συμπληρώματος C3 και C5b-C9 στους ιστούς. Αξιοπρόσεκτο ήταν και η χαρακτηριστικά μειωμένη επιστράτευση ουδετεροφίλων στην περιοχή της εντερικής ιστικής καταστροφής σε πειραματικά ποντίκια MRL/lpr με χαμηλά εως καθόλου επίπεδα παραγόντων συμπληρώματος σε σύγκριση με τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr που είχαν επαρκή επίπεδα παραγόντων συμπληρώματος όπως και η σαφής μείωση του οξειδωτικού φορτίου στο έντερο όπως αυτό μετρήθηκε με την ενεργότητα της περοξειδάσης της δισμουτάσης (SDA) και τα επίπεδα μεταγραφής του mRNA της περοξειδάσης της γλουταθειόνης (GPX-1). Επίσης παρατηρήθηκε και αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων μεταγραφής mRNA των προφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-1b, IL-6 και TNF-a).Στην συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση της εξάλειψης του συμπληρώματος στην ανάπτυξη της απομακρυσμένης ιστικής καταστροφής και συγκεκριμένα στους πνεύμονες των πειραματικών ποντικιών MRL/lpr. Δείξαμε ότι τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr που είχαν χαμηλά εως καθόλου επίπεδα παραγόντων συμπληρώματος είχαν μειωμένα επίπεδα ιστικής καταστροφής στους πνεύμονες σε σύγκριση με τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr που είχαν επαρκή επίπεδα παραγόντων συμπληρώματος μετά από επαγόμενη εντερική βλάβη Ι/Ε. Χαρακτηριστικά, η εναπόθεση του παράγοντα συμπληρώματος C3 στο πνευμονικό παρέγχυμα των πειραματικών ποντικιών MRL/lpr με εξάλειψη του συμπληρώματος ήταν σαφώς μειωμένη. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι η ρύθμιση της ενεργότητας του συμπληρώματος είναι ικανή να προστατεύσει τα ποντίκια επιρρεπή σε ΣΕΛ από την ιστική καταστροφή μετά από βλάβη Ι/Ε.Ταυτόχρονα σε αυτή την μελέτη παρουσιάζουμε ότι η χρήση του αναστολέα του υποδοχέα του C5a, σε πειραματικά ποντίκια ΜRL/lpr είναι ικανή να προστατεύσει τα ποντίκια αυτά από εντερική ιστική καταστροφή μετά από επαγόμενη εντερική βλάβη Ι/Ε. Δείχνουμε τόσο μια στατιστικά σημαντική βελτίωση της εντερικής ιστολογικής εικόνας των πειραματικών ποντικιών MRL/lpr που έλαβαν τον αναστολέα όσο και μια μεγάλη μείωση στην διείσδυση των ουδετεροφίλων στην περιοχή του λεπτού εντέρου. Παρόλα αυτά, η χρήση του C5aRA δεν ήταν ικανή να προστατεύσει τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr από την απομακρυσμένη ιστική καταστροφή στους πνεύμονες, υποδεικνύοντας ότι κάποιοι άλλοι παράγοντες συμμετέχουν στην οργάνωση της απομακρυσμένης καταστροφής μετά από βλάβη Ι/Ε. Όντως πρόσφατες μελέτες έχουν παρουσιάσει τόσο την ικανότητα των αιμοπεταλίων να ενεργοποιούν το συμπλήρωμα όσο και αντίστροφα αλλά και τον ρόλο των αιμοπεταλίων ως ρυθμιστών της ανοσολογικής απάντησης σε διάφορες καταστάσεις όπως η βλάβη Ι/Ε και τα αυτοάνοσα νοσήματα.Συμπερασματικά, αποδείξαμε ότι ο CVF, είναι ικανός προστατέψει τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr τόσο από την τοπική ιστική καταστροφή αλλά και την απομακρυσμένη ιστική καταστροφή μετά από επαγόμενη εντερική βλάβη Ι/Ε. Την ίδια ώρα παρουσιάζουμε την ευεργετική δράση του C5aRA στην έκφραση της τοπικής ιστικής καταστροφής στα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr μετά από βλάβη Ι/Ε. Ταυτόχρονα γεννιούνται νέα ερωτήματα για την ρύθμιση της απομακρυσμένης καταστροφή καθώς ο C5aRA αποτυγχάνει να προστατέψει τα πειραματικά ποντίκια MRL/lpr από την βλάβη αυτή. Ερωτήματα που προσπαθούμε να απαντήσουμε στην επόμενη ενότητα. 2η ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΕΝΟΤΗΤΑ: Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ 4 ΣΤΗΝ ΤΟΠΙΚΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΑΚΡΥΣΜΕΝΗ ΟΡΓΑΝΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΝΤΕΡΙΚΗ ΒΛΑΒΗ ΙΣΧΑΙΜΙΑΣ ΕΠΑΝΑΙΜΑΤΩΣΗΣ ΣΕ ΕΙΔΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΠΟΝΤΙΚΙΩΝ. Η συμμετοχή των αιμοπεταλίων και των πρωτεϊνών που εκκρίνουν όπως ο παράγοντας αιμοπεταλίων 5 (platelet factor 4, PF4) στην παθοφυσιολογία τη βλάβης Ι/Ε δεν έχει ξανά ερευνηθεί, πράγμα που επιχειρείται σε αυτή την ενότητα. Σε αυτή την ενότητα, για πρώτη φορά παρουσιάζουμε ένα νέο ρόλο της πρωτεΐνης PF4 στην ενορχήστρωση της απομακρυσμένης ιστικής καταστροφής μετά από βλάβη Ι/Ε. Πρώτα παρουσιάζουμε ότι τα επιθηλιακά εντερικά κύτταρα φαίνεται να παράγουν την πρωτεΐνη PF4 στο έντερο πράγμα που αποδεικνύεται με τις χρώσεις και την μέτρηση των επιπέδων έκφραση του mRNA της πρωτεΐνης PF4. Όπως δείξαμε η ομάδα Sham των πειραματικών ποντικιών είχε κάποια επίπεδα έκφρασης του mRNA του PF4 τα οποία αυξήθηκαν σημαντικά κατά την διάρκεια της επαγόμενης εντερικής βλάβης Ι/Ε. Αντίθετα δεν υπάρχει οποιαδήποτε μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης mRNA του PF4 στους πνεύμονες των πειραματικών ποντικιών μετά από βλάβη Ι/Ε (Εικόνα 9).Για να μελετήσουμε το ρόλο του PF4 στην έκφραση της ιστικής καταστροφής μετά από βλάβη Ι/Ε, χρησιμοποιήσαμε τα διαγονιδιακά ποντίκια PF4-/- στα οποία δεν παράγεται καθόλου η πρωτεΐνη PF4. Tα διαγονιδιακά ποντίκια PF4-/-, παρουσίασαν μειωμένη ιστική καταστροφή τόσο στους πνεύμονες όσο και στο λεπτό έντερο αντίστοιχα. Επιβεβαιώσαμε επίσης και την απουσία της πρωτεΐνης PF4 σε όλα τα διαγονιδιακά ποντίκια PF4-/- που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα μετρώντας τα επίπεδα PF4 στο πλάσμα.Στην συνέχεια, καθορίσαμε της διαφορές στην διείσδυση των ουδετεροφίλων και των μονοκυττάρων στους πνεύμονες και στο λεπτό έντερο των πειραματικών ποντικιών μετά από επαγόμενη εντερική βλάβη Ι/Ε. Βρήκαμε ότι η παρουσία των ουδετερόφιλων είχε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην ομάδα IR των πειραματικών ποντικιών B6. Σε αντίθεση , δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην παρουσία ουδετερόφιλων στα διαγονιδιακά ποντίκια PF4-/-. Μπορούμε με ασφάλεια να υποθέσουμε ότι η αυξημένη παρουσία των αιμοπεταλίων και κατ’ επέκταση του PF4, στις περιοχές των πνευμονικών αγγείων ως αποτέλεσμα της εντερικής βλάβης Ι/Ε, μπορεί να συνεισφέρει στην δημιουργία μιας διαβάθμισης συγκεντρώσεων των χημειοκινών που ελέγχουν την διαπίδυση των μονοκύτταρων και ουδετερόφιλων στην πλευρά της ιστικής καταστροφής. Γνωρίζοντας το ρόλο των ανοσοσφαιρινών και του συμπληρώματος στην διαδικασία της ιστικής καταστροφής μετά από βλάβη Ι/Ε, στα επόμενα πειράματα, θέλαμε να μετρήσουμε τα επίπεδα των ανοσοσφαιρινών στο πλάσμα και την εναπόθεση των ανοσοσφαιρινών και του συμπληρώματος στους ιστούς των πειραματικών ποντικιών. Δείξαμε ότι η απουσία του PF4 από τα διαγονιδιακά ποντίκια δεν επηρεάζει ούτε την εναπόθεση του παράγοντα C3, και των ανοσοσφαιρινών ΙgΑ και IgM αλλά ούτε και τα επίπεδα IgM και IgG στο πλάσμα των πειραματικών ποντικιών. Σε αντίθεση, τα επίπεδα της IgA στο πλάσμα, ήταν αυξημένα στις ομάδες Sham και ΙR των διαγονιδιακών ποντικιών PF4-/- σε σύγκριση με την ομάδα που δεν έκανε εγχείρηση επαγόμενης βλάβης Ι/Ε και όλων των ομάδων των πειραματικών ποντικιών B6.Για να καθορίσουμε ότι η πρωτεΐνη PF4 η οποία προέρχεται από τα αιμοπετάλια είναι ο κύριος ρυθμιστής της έκφρασης της απομακρυσμένης ιστικής καταστροφής συνεχίσαμε την μελέτη μας με μια σειρά πειραμάτων με μεταγγίσεις αιμοπεταλίων. Συγκεκριμένα, έγινε μετάγγιση αιμοπεταλίων PF4-/- σε πειραματικά ποντίκια B6 στα οποία πρώτα έγινε εξάλειψη των δικών τους αιμοπεταλίων με την χρήση ειδικού αντισώματος. Η μετάγγιση αυτή ήταν ικανή να προστατέψει τα πειραματικά ποντίκια B6, από απομακρυσμένη ιστική καταστροφή στους πνεύμονες σε σύγκριση με τα πειραματικά ποντίκια B6 που δεν έλαβαν ξένα αιμοπετάλια. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η μετάγγιση των αιμοπεταλίων B6 σε διαγονιδιακά ποντίκια PF4-/- στα οποία επίσης έγινε εξάλειψη των δικών τους αιμοπεταλίων με την χρήση ειδικού αντισώματος, ήταν ικανή να οδηγήσει στην επανεμφάνιση τόσο της τοπικής εντερικής ιστικής καταστροφής αλλά και της απομακρυσμένης ιστικής καταστροφής στους πνεύμονες αυτών των ποντικιών.Η δική μας μελέτη διαφωτίζει για πρώτη φορά τη σημασία της πρωτεΐνης PF4 στην βλάβη Ι/Ε αναδεικνύεται για πρώτη φορά σε αυτή την μελέτη. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ξεκάθαρα τον ιδιαίτερο ρόλο του PF4 στην ενορχήστρωση της ανοσολογικής απάντησης και τον αναδεικνύουν ως ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για την αντιμετώπιση της ιστικής καταστροφής μετά από βλάβη Ι/Ε.