Μελέτη σύνδεσης και βιοδραστικότητας βιταμινών μετά από τη σύνδεσή τους με πρωτεϊνικά και λιπιδικά μόρια

Abstract

Τhe aim of this thesis is the association and bioactivity studies of lipophilic vitamins' binding to proteins and lipid mοlecules.Vitamins are organic compounds, vital for an organism. Fat-soluble vitamins (A, D, E and K) are sensitive molecules, fat dependent for their adequate absorption. As a consequence, fat soluble vitamins have limited intake and absorption in low fat food due to absence of their natural carriers (lipoproteins), which are removed from these foods and due to their low solubility in aqueous solutions.Encapsulation systems [use of specific proteins and lipidic vehicles (liposomes)] are a promising approach to preserve encapulated lipophilic vitamins' native properties over time and increase their concentration in aqueous media but also enhance absorption and bioavailability. Protein molecules which possess carrier properties and lipid structures such liposomes can efficiently entrap and deliver-release the encapsulated sensitive molecules.Studying two different carries provides the advandage of choice, regarding size, type (liposome and protein), origin (synthetic or natural molecule) and of course cost.In order to evaluate the encapsulation of lipophilic vitamins within a new lipid carrier, a liposome-protein complex was developed. This new formulation contained both lipidic and protein molecules [beta-Lactoglobulin (β-Lg)], and simulates structure of cell membrane.Liposomes have been assessed as efficient carriers for protection, controlled delivery and performance of sensitive molecules. The β-Lg has been selected as a model protein because of its own ability to bind lipophilic molecules. Various different techniques were used to evaluate this new formulation.The results of this study showed that the newly synthesized delivery system (liposome/ β-Lg) presents high encsapsulation efficiency of vitamins A, E and D. and a promising stability behavior. This could be an important factor, regarding its use as a carrier for sensitive molecules.To further evaluate the effectiveness of this new carrier, in vivo experiments of vitamin A were carried out in laboratoty animals (mice). According to the results, vitamin A proved to have an efficient bioavailability profile in serum when it was encapsulated into the new carrier and administered in aqueous media. The binding properties of the four vitamins with β-Lg (the selected model carrier protein) were also studied. The binding affinity of the fat soluble vitamins with the β-Lg was evaluated by using a highly sensitive technique (Isothermal Titration Calorimetry- ITC). Satisfactory binding constants were measured for all vitamins, thus making β-Lg a powerful and effective protein carrier.In conclusion, the results of this study can be used as a model for assessing the actual behavior of lipid and protein carriers, in various applications such as foods and/or biological systems. The modified concentration, bioavailability and antioxidant protection of vitamins, after their encapsulation or binding with specific lipidic and/or protein carriers which studied under this thesis, are expected to have applications in food and pharmaceutical formulations.

Αντικείμενο της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη της σύνδεσης των τεσσάρων λιποδιαλυτών βιταμινών με πρωτεϊνικά και λιπιδικά μόρια. Οι βιταμίνες αποτελούν μία τάξη οργανικών χημικών ενώσεων, απαραίτητες για τον οργανισμό. Οι λιποδιαλυτές βιταμίνες (A, D, E και Κ) είναι ευαίσθητα μόρια και εξαρτώνται από τα διατροφικά λιπαρά για την απορρόφηση και μεταφορά τους. Ένα πρόβλημα των λιποδιαλυτών βιταμινών αποτελεί η μειωμένη απορρόφησή τους σε τρόφιμα με χαμηλά λιπαρά λόγω της απουσίας των κατάλληλων φορέων τους, των λιποπρωτεϊνών. Για τον λόγο αυτό, η πρόσληψη και απορρόφηση των λιπόφιλων βιταμινών από τα τρόφιμα αυτά είναι αισθητά μειωμένη μιας και η διαλυτότητά τους σε υδατικά διαλύματα είναι εξαιρετικά χαμηλή.Η ανάγκη δημιουργίας ενός φορέα μέσω του οποίου θα επιτευχθεί αύξηση της πρόσληψης αλλά και της απορρόφησης των λιπόφιλων βιταμινών σε υδατικά μέσα αποτελεί επιτακτική ανάγκη. Η χρήση πρωτεϊνικών μορίων και αμφίφυλων λιπιδικών υπερδομών (λιποσωμάτων) μπορεί να αποβεί χρήσιμη αφού αυξάνει την διαλυτότητά των βιταμινών, χωρίς να αλλάζει τον υδρόφιλο χαρακτήρα του μέσου. Η μελέτη δυο διαφορετικών φορέων δίνει την δυνατότητα επιλογών σχετικά με: το μέγεθος του φορέα, την φύση (λιπόσωμα ή πρωτεϊνικό μόριο), το είδος (φυσικό προϊόν ή κατασκευασμένο) και φυσικά το κόστος.Στα πλαίσια λοιπόν της μελέτης της σύνδεσης των λιπόφιλων βιταμινών με λιπιδικές υπερδομές, έγινε η ανάπτυξη και η εκτίμηση ενός νέου λιπιδικού φορέα (λιπόσωμα/β-Lg) που προσομοιάζει με την δομή της κυτταρικής μεμβράνης αφού περιέχει εκτός των λιπιδίων και την πρωτεΐνη β-γαλακτοσφαιρίνη (β-Lg).Τα λιποσώματα έχουν ήδη αξιολογηθεί ως αποδοτικοί φορείς για την προστασία, την μεταφορά και την ελεγχόμενη διάθεση ευαίσθητων μορίων. Η β-Lg έχει επιλεχθεί ως πρωτεΐνη μοντέλο εξαιτίας της ικανότητάς της να προσδένει λιπόφιλα μόρια. Διάφορες τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση τόσο της απόδοσης όσο και της σταθερότητας του νέου αυτού φορέα. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν ότι το νεοδημιουργηθέν σύστημα εγκλωβισμού στο οποίο συνδυάζονται ο λιποσωμικός φορέας και η β-Lg (και τα οποία είναι φυσικής προελεύσεως) παρουσίασε υψηλό ποσοστό εγκλωβισμού για τις βιταμίνες Α, Ε και D και μία βελτιωμένη σταθερότητα. Κατ’ επέκταση μπορεί να παρέχει αυξημένη προστασία για το εγκλωβιζόμενο μόριο. Τα χαρακτηριστικά αυτά υποδηλώνουν ότι ο νέος φορέας αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο σύστημα εγκλωβισμού και μεταφοράς.Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η αποτελεσματικότητα του νέου φορέα, πειράματα βιοδραστικότητας της βιταμίνης Α έγιναν σε πειραματόζωα, δείχνοντας μία ικανοποιητική βιοδιαθεσιμότητα στο αίμα, όταν αυτή χορηγήθηκε σε υδατικό μέσο, εγκλωβισμένη στον νέο φορέα. Επιπλέον, η σύνδεση των βιταμινών με την πρωτεΐνη- φορέα β- Lg μελετήθηκε εκτενώς. Εκτιμήθηκε πόσο ισχυρά συνδέονται οι τέσσερις λιπόφιλες βιταμίνες στην θέση πρόσδεσης που φέρει με μία εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική προσδιορισμού (Θερμιδομετρία Ισόθερμης Τιτλοδότησης). Υπολογίστηκε μία σταθερά σύνδεσης αρκετά ικανοποιητική και για τις τέσσερις βιταμίνες, καθιστώντας έτσι την β-Lg έναν ισχυρό και αποτελεσματικό πρωτεϊνικό φορέα.Εν κατακλείδι, η τροποποιημένη συγκέντρωση, αντιοξειδωτική προστασία και βιοδιαθεσιμότητα των βιταμινών μετά από τον εγκλωβισμό ή σύνδεση με τους συγκεκριμένους λιπιδικούς και πρωτεϊνικούς φορείς που μελετήθηκαν σε αυτή την εργασία, αναμένεται να έχει άμεσες εφαρμογές σε τρόφιμα ή/και φαρμακευτικά σκευάσματα.