Η μελέτη της τελομεράσης και της κυκλοξυγενάσης-ΙΙ στα καρκινώματα του παχέος εντέρου

Abstract

Background: Colorectal cancer (CRC) is one of the commonest cancers and the third lead-ing cause of cancer death in both sexes. The disease progresses as a multi-step process and is associated with genetic alterations and epigenetic changes. Throughout this mutation process telomerase activation (hTERT) plays a catalytic role in the tumor progression cas-cade. During the last decade multiple studies have linked the cycloxygenase-2 (COX-2) ex-pression with the pathogenesis of various types of cancers, included the CRC. Although the actual mechanisms that control COX-2 expression have not been widely understood, it has been shown that stroma cells of both, tumors and the adjacent normal tissues, contribute to COX-2 over-expression resulting in PGE2 synthesis from arachidonic acid. Peptide hormone somatostatin and its receptors (sstr) have a wide range of physiological functions and play a role in the treatment of numerous human diseases, including CRC. Somatostatin and its syn-thetic analogue, octreotide, are potentially active against CRC due to their anti-proliferative and apoptosis-induced activity. Octreotide inhibits growth of colonic cancer cells. Insulin is a peptide hormone produced by the beta pancreatic cells, and it has also been shown to initi-ate mitogenic signals in certain cell types, acting as a trophic factor in tumor cells. Methods – Aims: The aim of this study is to evaluate the in-vivo telomerase activity by [Re-al-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)] in colon and rectal cancer tissues and their corresponding adjacent normal mucosal tissues [10cm away from the tumor]. We compared hTERT in tumors located in different colon locations [right colon, left colon and rectum] and analyzed the association between hTERT with patients’ clinicopathological features [sex, age, BMI, smoking habits, tumor differentiation (grade), Dukes & TNM stage] and survival. We also studied MLH1 as an indicator of Microsatellite Instability (MIS), while p53 and other molecular markers [Ki-67, Bcl-2] were also studied and correlated with telomerase activity. Our aim also is to study the immunohistochemistry expression of COX-2 together with PGE2 synthesis on CRC and to correlate with a) clinicopathological parameters of the patients and b) telomerse activity (hTERT). Furthermore the in-vitro aim of study was to subsequently study the effects of the somatostatin analogue octreotide with or without the trophic effects of insulin on cellular proliferation of colon cancer cell lines (Caco-2 & HT-29) and octreotide ac-tion in correlation with hTERT. We also investigated the effect of the protein of tyrosine phosphatases (PTPs) and telomerase activity on cellular proliferation.Results - Discussion: In our study we included 49 patients (21 women) with a median age of 74 (range 49–87) years with biopsy-confirmed CRC. There was a significantly higher te-lomerase activity in colon cancer tissue compared to normal tissue (p=0,006). Adenocarci-nomas of the colon cancers express significantly higher hTERT compared to rectal cancers (p=0,012). The same was repeated in the adjacent normal tissues (p=0,035). Furthermore colon cancers and their adjacent normal tissues had significantly more telomerase and were more positive to MLH1 compared to rectal cancers. The expression of p53 was negatively correlated to telomerase activity but was linked to better patient survival. As far as the im-munohistochemistry expression of COX-2 is concerned, that was positively expressed in 40 out of 49 cancer tissues (81.6%). The immunostaining was cytoplasmic, heterogeneous and its intensity was ranged from mild to intense. COX-2 was also expressed in less extend in tumor stroma. The same COX-2 expression was also observed in the adjacent normal tissue stroma cells. The latter was also confirmed when PGE2 synthesis was found to be higher in normal mucosa tissues compared to the adjacent cancer tissues (p=0,013). There was no statistical significant relation of COX-2 expression with the above-mentioned patients’ clini-copathological parameters. Interestingly, adjacent normal tissue of Dukes-C/D stage tumors had significantly less PGE2 synthesis (p=0,036) and lower telomerase activity (hTERT) (P=0,005), than adjacent normal tissue of Dukes A/B-stage tumors. These results might im-ply that in early stages normal epithelium or its surrounding stroma cells might be more sus-ceptible to new telomerase or COX-2 respectively, driven tumor formation while in late stag-es the extent of the systemic illness may decrease this potency or that there might be a less powerful regeneration process of the normal colonic epithelium in late stages of colon can-cer. When tumors were grouped by a) right colon (cecum, ascending colon, transverse co-lon), we observed higher hTERT activity and less PGE2 synthesis and b) by left colon (splen-ic flexure, descending colon, sigmoid and rectal cancers), we observed more but not signifi-cant PGE2 synthesis and significantly lower hTERT activity (p=0,012). The in-vitro experi-mental protocol, determined elevated expression of sst1, sst2 and sst5 in both colon cancer cell lines (Caco-2 & HT-29) by RT-PCR. Immunocytochemistry detected sst1, sst2A, sst2B, sst3, and sst4 and sst5 protein expression in the membranes of both cell lines. Octreotide treatment inhibited the proliferation of Caco-2 and HT-29 cells through the protein of tyrosine phosphatases (PTPs). Insulin treatment exerted proliferative effects while octreotide re-versed its effect in both cell lines. Sodium orthovanadate (Na3VO4) suppressed the anti-proliferative effect of octreotide both in Caco-2 and HT-29 cells. After octreotide treatment, colonic cancer cell-lines (Caco-2 & HT-29), that grow in cultured medium (10%FBS), exert their action on hTERT, through different signaling pathways. Conclusions - Applications: Our findings further support the concept of multiple molecular entities within the spectrum of CRC. The differences that others and we have identified in telomerase activity and COX-2 expression, in colon and rectal cancers may be related to the diversity of carcinogenesis and disease progression mechanisms in these distinct locations that can be attributed to their discrete embryology, anatomy, physiology and molecular biolo-gy. We confirmed that colon and rectum behave as different entities (organs) with different characteristics and properties. Furthermore it seems like COX-2 is implicated in the initial steps of colorectal carcinogenesis progression, affecting initially the adjacent normal colon surrounding stroma cells and then move to colon cancer epithelial cells. Treatment should only be given for the prevention of CRC, especially for the left colon and rectum where COX-2 was highly expressed. The difference in p53 expression between right – left colon and rec-tum together with p53 prognostic role, will positively contribute to a better design of chemo-therapy treatment. It would be thus important to investigate in which way p53 expression could benefit patient’s response on particular chemotherapeutic regimens. Our in-vitro data indicate that the treatment of metabolic syndrome (insulin resistance), may suppress carcin-ogenesis at least in certain locations on colon and rectum. The use of octreotide could pro-vide a possible therapeutic approach for the treatment of patients with colon cancer at certain locations in the colon and rectum.

Εισαγωγή: Ο ορθοκολικός καρκίνος (ΟΚΚ) είναι ένας από τους πιο συχνούς καρκίνους και η τρίτη αιτία θανάτου από καρκίνο και στα δύο φύλα. Η νόσος εξελίσσεται σαν μια διαδικασία πολυσταδιακή και συνοδεύεται από πολλές γενετικές μεταβολές και επιγενετικές τροποποιήσεις. Ανάμεσα σε αυτή τη διαδικασία μεταλλαγών, η ενεργοποίηση της τελομεράσης (hTERT) παίζει καταλυτικό ρόλο στον καταρράκτη της εξέλιξης του όγκου. Την τελευταία επίσης δεκαετία πολλές μελέτες έχουν συνδέσει την αυξημένη έκφραση της κυκλοξυγενάσης-2 (COX-2) με την παθογένεια πολλών τυπων καρκίνου στον άνθρωπο, συμπεριλαμβάνομένου και του ΟΚΚ. Ενώ οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την έκφραση αυτή δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως, εντούτοις καταδείκνύεται ότι τα κύτταρα του στρώματος του όγκου αλλά και του παρακείμενου φυσιολογικού ιστού συνεισφέρουν στην ενίσχυση της έκφρασης της COX-2 και κατ’ επέκταση στην αύξηση της παραγωγής προσταγλανδινης-Ε2 (PGE2) από το αραχιδονικό οξύ.Η σωματοστατίνη και οι υποδοχείς (sstr) της χαρακτηρίζονται από ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών λειτουργιών καθώς διαδραματίζουν ρόλο στην θεραπεία αρκετών νοσημάτων περιλαμβάνοντας και τον ΟΚΚ. Η οκτρεοτίδη είναι ένα συνθετικό πεπτίδιο ανάλογο της σωματοστατίνης που αναστέλλει (in-vitro) την ανάπτυξη κυτταρικών σειρών καρκίνου παχέος εντέρου. Η ινσουλίνη επίσης σαν τροφικός παράγοντας θέτει σε λειτουργία μιτογόνα σήματα σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων όπως και στον ΟΚΚ. Μέθοδοι - Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική μελέτη αποσκοπεί στην in-vivo εκτίμηση της ενεργότητας της τελομεράσης στους καρκινικούς ιστούς του παχέος εντέρου και του ορθού και του αντίστοιχου παρακείμενου φυσιολογικού βλεννογόνου [10εκ. μακρυά από τον όγκο]. Σκοπός επίσης είναι η σύγκριση της ενεργότητας της τελομεράσης στους όγκους που εντοπίζονται σε διαφορετικά τμήματα του παχέος εντέρου [δεξιό-αριστερό κόλο και ορθό] και στην αναλύση της σχέσης μεταξύ της hTERT και των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών [φύλο, ηλικία, ΔΜΣ, καπνισμα, βαθμό διαφοροποίησης (grade) του όγκου, στάδιο νόσου κατά Dukes και TNM], συμπεριλαμβανομένης και της επιβίωσης των ασθενών. Επιπλέον σκοπός είναι να μελετήσουμε την έκφραση του γονιδίου MLH1 ως ένδειξη μικροδορυφορικής αστάθειας (MSI), την έκφραση του p53 και άλλων βιολογικών δεικτών [Bcl-2, Ki-67] οι οποίοι συσχετίστηκαν με την hTERT. Τέλος, σκοπός είναι η in-vivo μελέτη της ανοσοϊστοχημικής έκφραση της COX-2 αλλά και της σύνθεσης της PGE2 στα αδενοκαρκίνωματα του παχέος εντέρου και του ορθού και η συσχέτιση τους με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους των ασθενών αλλά και με την hTERT. In-vitro σκοπός είναι η διερεύνηση της δράσης της οκτρεοτίδης με ή χωρίς την επίδραση του τροφικού παράγοντα (ινσουλίνης), στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυταρικών σειρών Caco-2 και HT-29 και η σύγκριση της δράση αυτής με την hTERT, καθώς και η μελέτη της συμμετοχής του αναστολέα της πρωτεϊνης των τυροσινικών φωσφατασών (Sodium Orthovanadate - Na3VO4) στη ρύθμιση του αντι-πολλαπλασιαστικού δυναμικού της οκτρεοτίδης.Αποτελέσματα - Συζήτηση: Συμπεριλάβαμε 49 ασθενείς (21 γυναίκες) μέσης ηλικίας 74 ετών (όρια 49-87) με ΟΚΚ επιβεβαιωμένο με βιοψία. Υπήρξε σημαντικά υψηλότερη ενεργότητα τελομεράσης στους καρκινικούς ιστούς συγκριτικά με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς (p=0,006). Η έκφραση της τελομεράσης ήταν στατιστικά υψηλότερη στο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, συγκριτικά με τους καρκίνους που ευρίσκονταν στο ορθό (p=0,012). Το ίδιο επαναλήφθηκε και στους αντίστοιχους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς (p=0,035). Οι καρκίνοι του παχέος εντέρου μαζί με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς εξέφραζαν στατιστικά περισσότερη τελομεράση και ήταν περισσότερο θετικοί στο γονίδιο MLH1 συγκριτικά με τους καρκίνους του ορθού. Η έκφραση του p53, συσχετίστηκε αρνητικά με την ενεργότητα της τελομεράσης αλλά συνδυάστηκε με καλύτερη επιβίωση των ασθενών.Οσον αφορά την ανοσοιστοχημική έκφραση της COX-2, αυτή ήταν θετική σε 40 από τις 49 περιπτώσεις καρκινικού ιστου που εξετάστηκαν (81.6%). Η χρωστική αντίδραση ήταν κυτταροπλασματική, ετερογενής και η ένταση της ήταν από μέτρια έως έντονη. Ασθενέστερη χρώση επίσης ανιχνευθηκε και στα στρωματικά κύτταρα του όγκου. Παρατηρήθηκε επίσης αντίστοιχη έκφραση COX-2 και στο στρώμα των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Επιβεβαίωση αυτού αποτελεί η πειραματική παρατήρηση περισσότερης σύνθεσης PGE2 στους φυσιολογικούς ιστούς συγκριτικά με τους αντίστοιχους καρκινικούς ιστούς (p=0.013). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική σχέση της έντασης και του ποσοστού της έκφρασης της COX-2 με όλες τις ανωτέρω κλινικοπαθολογικές παραμέτρους. Υπήρξε σημαντικά λιγότερη σύνθεση PGΕ2 (p=0,036) και λιγότερη hTERT (p=0,005), τους φυσιολογικούς ιστούς ασθενών με καρκίνο σταδίου Dukes C/D συγκριτικά με τους φυσιολογικούς ιστούς ασθενών με καρκίνο σταδίου Dukes A/B. Αυτό μπορεί να υπονοεί ότι σε αρχικά στάδια νόσου το φυσιολογικό επιθήλιο του εντέρου μπορεί να είναι πιο ευπαθές σε δημιουργία όγκου μέσω της τελομεράσης, ενώ σε προχωρημένα στάδια νόσου το δυναμικό αυτό μειώνεται ή μπορεί επίσης να υπάρχει ανεπάρκεια της αναγεννητικής διαδικασίας στο φυσιολογικό ιστό σε προχωρημένη νόσο με καρκίνο εντέρου. Επίσης μπορεί αυτό να υποδηλώνει ότι στα αρχικά στάδια το φυσιολογικό μικροπεριβάλλον (στρώμα) των ασθενών μπορεί να είναι πιο επιδεκτικό στην δημιουργία όγκων μέσω του μονοπατιού της COX-2, ενώ σε προχωρημένο στάδιο νόσου η επέκταση του καρκίνου μπορεί να μειώνει αυτή την ικανότητα. Στους καρκίνους του δεξιού κόλου υπήρχε λιγότερη σύνθεση PGE2 και περισσότερη έκφραση hTERT, συγκριτικά με τους καρκίνους του αριστερού κόλου και του ορθού στους οποίους παρουσιάζεται αυξημένη αλλά μη σημαντική σύνθεση PGE2 και μειωμένη αλλά στατιστικά σημαντική έκφραση hTERT (p=0,006). Στο in-vitro πειραματικό πρωτόκολλο, αυξημένη έκφραση των υποδοχέων σωματοστατίνης (sst1, sst2, sst5) επιβεβαιώθηκε και στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (Caco-2 & HT-29) με RT-PCR. Επιπλέον με χρήση ανοσοκυτταροχημείας ανιχνεύτηκε η έκφραση των πρωτεϊνών των sst1, sst2A, sst2B, sst3, sst4, sst5, στη μεμβράνη και των δύο κυτταρικών σειρών. Η επίδραση οκτρεοτίδης ασκει αντι νεοπλασματική δράση στα (Caco-2 & HT-29) μέσω της πρωτεΐνης των τυροσινικών φωσφατασών (PTPs). Η επίδραση ινσουλίνης ασκεί τροφική δράση στα (Caco-2 & HT-29), καθώς η οκτρεοτίδη αντιστρέφει την δράση της και στις δύο κυτταρικές σειρές. To Na3VO4, προκαλεί καταστολή της δράσης της οκτρεοτιδης και στις δύο κυτταρικές σειρές. Οι δύο κολονικές σειρές (Caco-2 & HT-29) αναπτυσσόμενες σε θρεπτικό υλικό 10%FBS, υπό την επίδραση οκτρεοτίδης συμπεριφέρονται διαφορετικά στην ενεργότητα της τελομεράσης, ένδειξη διαφορετικών σηματοδοτικών μονοπατιών.Συμπεράσματα - Εφαρμογές: Τα ευρήματα μας υποστηρίζουν περαιτέρω την υπόθεση της ύπαρξης των πολλαπλών μοριακών οντοτήτων στο ευρύ φάσμα του ΟΚΚ. Οι διαφορές που εμείς και άλλοι έχουμε βρει όσον αφορά την ενεργότητα της τελομεράσης, την έκφραση της COX-2, στο καρκίνο του παχέος έντερου και του ορθού, μπορεί να σχετίζονται με την ποικιλομορφία της καρκινογένεσης. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην εξέλιξη της νόσου στις διαφορετικές εντοπίσεις του όγκου στο έντερο μπορεί να αποδοθούν στη ξεχωριστή εμβρυολογία, ανατομία, φυσιολογία, και μοριακή βιολογία του κάθε τμήματος του παχέος εντέρου και του ορθού. Μέσω των αποτελεσμάτων μας επιβεβαιώσαμε ότι το παχύ έντερο και το ορθό φαίνεται να αποτελούν ξεχωριστές οντότητες με διαφορετικά χαρακτηριστικά και ιδιότητες. Επιπλέον η COX-2 φαίνεται να εμπλέκεται στα αρχικά στάδια εξέλιξης του ογκογενετικού μηχανισμού του ΟΚΚ και συγκεκριμένα επηρεάζοντας αρχικά τον ξενιστή του όγκου (μικροπεριβάλλον του στρώματος) στα φυσιολογικά κύτταρα και μετέπειτα στα επιθηλιακά κύτταρα του ιδίου του όγκου. Θεραπεία ίσως θα πρέπει να δοθεί για την πρόληψη του ΟΚΚ παρά για την καταστολή της εξέλιξης αυτού ιδιαίτερα στους όγκους του αριστερόυ κόλου και του ορθού στους οποίους η έκφραση βρέθηκε μεγαλύτερη. Η διαφορά στην έκφραση p53 μεταξύ δεξιού και αριστερού κόλου (και ορθού) σε συνδυασμό με την πιθανή προγνωστική σημασία του p53 θα συμβάλει ενδεχομένως στον καλύτερο σχεδιασμό χημειοθεραπευτικής αγωγής. Επομένως θα ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί αν και με ποιόν τρόπο η έκφραση του p53 θα μπορούσε να σχετίζεται με την απόκριση των ασθενών σε συγκεκριμένα χημειοθεραπευτικά σχήματα.Τα δεδομένα της in-vitro μελέτης μας δείχνουν ότι η αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου, μειώνοντας την ινσουλίνη και τον IGF-1 (τροφικοί παράγοντες), ίσως καταστείλει την ογκογενετική εξέλιξη σε συγκεκριμένες τουλάχιστον περιοχές στο παχύ έντερο και το ορθό. Η χρήση της οκτρεοτίδης θα μπορούσε να παρέχει θεραπευτική προσέγγιση στην αντιμετώπιση ασθενών με ΟΚΚ σε συγκεκριμένες περιοχές του παχέος εντέρου και του ορθού.