Φαινοτυπικός και γονοτυπικός έλεγχος στελεχών Pasteurella multocida και Mannheimia haemolytica που απομονώθηκαν από πνεύμονες μηρυκαστικών (προβάτων, αιγών, βοοειδών) και χοίρων

Abstract

The aim of this study was to phenotypically and genotypically characterize P. multocida and M. haemolytica strains isolated from pneumonic lungs of ruminants and pigs. Bacterial identification was performed using biochemical testing and PCR assays. A multiplex PCR assay was used for the capsular typing (types A, B, D, E and F) of P. multocida isolates, while an indirect haemagglutination test was used for serotyping M. haemolytica isolates. Furthermore, isolates were investigated for the presence of certain virulence genes. PCR assays were used to detect the presence of the toxA gene and the ompA gene in P. multocida isolates and the presence of the lktA gene and the ompA gene in M. haemolytica isolates. Moreover, a PCR-RFLP method and DNA sequence analysis were used to study the polymorphisms of the ompA nucleotide sequences obtained from P. multocida isolates. Among M. haemolytica isolates, the lktA and the ompA nucleotide sequences were analysed by DNA sequencing, while the polymorphisms of the ompA nucleotide sequences were also studied using DGGE.The purpose of the present study was to investigate the prevalence of the two bacterial species, to identify any possible association of the most prevalent types and serotypes with age or with different animal species, and to compare the serotypes found among the isolates with those used in commercial vaccines. Furthermore, this study was undertaken to investigate the pathogenicity of the isolates by determining the genetic diversity of important virulence genes, and to propose, if possible, a protocol of rapid and reliable identification based on molecular methods. Pneumonic lung tissue samples were collected from 21 slaughterhouses throughout Greece. Four-hundred and ninety-one tissue samples were examined: 247 of these samples originated from sheep, 66 from cattle, 47 from goats and, finally, 131 samples originated from pigs. In addition, eight lung tissue samples that originated from animals with clinical signs of pneumonia were examined.In total, 144 P. multocida strains and 103 M. haemolytica strains were isolated. However, the isolation rate varied among the different species. P. multocida was recovered from bovine lungs at 28.8% and M. haemolytica at 1.5%, while, in small ruminants, the recovery rate was 14.9-17.8% and 31.9-35.2% respectively. As it was expected, only P. multocida was isolated from porcine lungs (56.5%).Among the P. multocida isolates, capsular types A (86.1%), D (13.2%) and F (0.7%) were found. The majority of the bovine isolates belonged to type A (94.7%), while only one isolate belonged to type D. The majority of the ovine isolates also belonged to type A (61.4%) but a significant percentage of type D strains (38.6%) was found as well. In caprine isolates, apart from the predominant type A (71.4%), types D and F were also found (this is the first report of a type F strain isolated from a goat). Finally, type A was the only type found among the porcine isolates.The toxA gene was detected in 43% of the P. multocida isolates. The detection rate was quite low among the porcine and the bovine isolates (2.3% and 5.3% respectively). In contrast, the toxA gene was detected at an unexpectedly high rate in small ruminants (85.7% among caprine isolates and 93.2% among ovine isolates), suggesting a more important epidemiological role of toxA-positive strains for these animal species.Analysis of the ompA sequences from the P. multocida isolates revealed a great heterogeneity among the isolates, which were classified in 11 genotypic groups. However, the ruminant strains could be differentiated from the porcine strains both by DNA sequence analysis and by the PCR-RFLP method.Among the M. haemolytica isolates, serotype A2 was the most prevalent (47.8%). All the caprine strains and 36.8% of the ovine strains belonged to serotype A2; the remaining six serotypes that were isolated (A1-14.5%, A7-13.2%, A9-9.2%, A12-9.2%, A6-3.9% and A5-5.2%) were found only among ovine strains. It is interesting that 11.8% of the serotypes found among ovine isolates are not represented in commercial vaccines.Analysis of the ompA sequences revealed nine genotypic groups among the M. haemolytica isolates. Ovine isolates showed greater heterogeneity and were classified in eight groups, two of which were the most prevalent. In contrast, the majority of the caprine strains comprised one distinct genotypic group, while the rest of the caprine strains were classified in the two most common "ovine" groups. Analysis of the ompA sequences with DGGE could also differentiate the majority of the caprine strains from the ovine ones.The lktA gene was detected in all M. haemolytica isolates that were examined. The caprine strains belonged to two genotypes, while five different genotypes were identified among the ovine strains. The significant number of polymorphisms found in conserved, hydrophobic domains of the gene and the increased probability of certain lktA sequences to act as a mitochondrial targeting signal (MTS) are two important findings that warrant future investigation.It should be mentioned that no specific geographical distribution was noticed for any of the characters investigated in this study. In contrast, increased heterogeneity was noticed among isolates that originated from the same farm. Perhaps this is a factor that should be taken under consideration for the production of more efficient vaccines.Analysis of the ompA sequences from the P. multocida and M. haemolytica isolates showed that certain alleles were associated with a single animal species, potentially revealing host specificity. Therefore, the ompA gene could serve as a target for the development of a molecular typing method of P. multocida and M. haemolytica isolates. To our knowledge, the results of the present study concerning the genetic diversity of the ompA gene from P. multocida isolates are the only, so far, available data on this subject.

Η παρούσα έρευνα είχε ως στόχο το φαινοτυπικό και γονοτυπικό έλεγχο στελεχών της P. multocida και της M. haemolytica που απομονώθηκαν από πνεύμονες μηρυκαστικών και χοίρων. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με βασικές βιοχημικές δοκιμές, καθώς και με τη μέθοδο της PCR. Η μέθοδος της PCR χρησιμοποιήθηκε και για τη διάκριση των τύπων (A, B, D, E και F) των στελεχών της P. multocida, ενώ η οροτυποποίηση των στελεχών της M. haemolytica έγινε με τη μέθοδο της έμμεσης αιμοσυγκόλλησης. Επιπλέον, τα στελέχη εξετάσθηκαν για την παρουσία γονιδίων λοιμοτοξικότητας. Συγκεκριμένα, με τη μέθοδο της PCR, ανιχνεύθηκαν τα γονίδια toxA και ompA της P. multocida και τα γονίδια lktA και ompA της M. haemolytica. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ompA της P. multocida με τη μέθοδο PCR-RFLP και την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA του γονιδίου. Στα στελέχη της M. haemolytica, έγινε ανάλυση της αλληλουχίας του DNA των γονιδίων lktA και ompA, ενώ για τη μελέτη των πολυμορφισμών στο γονίδιο ompA χρησιμοποιήθηκε και η μέθοδος DGGE.Σκοπός της έρευνας ήταν η διερεύνηση του επιπολασμού των δύο ειδών βακτηρίων, ο συσχετισμός των επικρατέστερων τύπων και οροτύπων τους με τα διαφορετικά είδη ζώων και την ηλικία τους, καθώς και η σύγκρισή τους με τους ορότυπους που χρησιμοποιούνται στα εμβόλια. Επιπλέον, στόχος της παρούσας έρευνας ήταν η μελέτη της λοιμογόνου ικανότητας των στελεχών με τη μοριακή ανάλυση σημαντικών γονιδίων λοιμοτοξικότητας, καθώς και η αξιοποίηση των αποτελεσμάτων για τη δημιουργία πρωτοκόλλου ταχείας και αξιόπιστης ταυτοποίησης των στελεχών, με τη χρήση μεθόδων μοριακής βιολογίας. Πνεύμονες με μακροσκοπικές αλλοιώσεις πνευμονίας (ηπάτωση) συλλέχθηκαν από 21 συνολικά σφαγεία όλης της χώρας. Εξετάσθηκαν συνολικά 491 δείγματα, από τα οποία τα 247 προήλθαν από πρόβατα, 66 από βοοειδή, 47 από αίγες και 131 από χοίρους. Παράλληλα εξετάσθηκαν και οκτώ δείγματα πνευμονικού ιστού ζώων από εκτροφές, τα οποία παρουσίαζαν κλινικά συμπτώματα πνευμονίας.Απομονώθηκαν συνολικά 144 στελέχη P. multocida και 103 στελέχη M. haemolytica. Ο επιπολασμός των δύο βακτηριακών ειδών βρέθηκε να διαφέρει ανάμεσα στα είδη των ζώων που μελετήθηκαν. Συγκεκριμένα, ο επιπολασμός της P. multocida στα βοοειδή ήταν 28,8% και της M. haemolytica 1,5%, ενώ, αντίθετα, στα μικρά μηρυκαστικά, τα ποσοστά κυμαίνονταν μεταξύ 14,9-17,8% και 31,9-35,2% αντίστοιχα. Στους χοίρους, απομονώθηκε, όπως αναμενόταν, μόνο η P. multocida (σε ποσοστό 56,5%).Μεταξύ των στελεχών της P. multocida, βρέθηκαν οι τύποι Α (86,1%), D (13,2%) και F (0,7%). Στα βοοειδή, το σύνολο σχεδόν των στελεχών ήταν τύπου Α (94,7%), ενώ μόνο ένα στέλεχος ήταν τύπου D. Στα πρόβατα, βρέθηκαν επίσης οι τύποι Α και D, σε ποσοστό 61,4% και 38,6% αντίστοιχα. Στις αίγες, εκτός από τον κυρίαρχο τύπο Α (71,4%), βρέθηκαν οι τύποι D και F (ο τύπος F αναφέρεται για πρώτη φορά στις αίγες). Τέλος, στους χοίρους, βρέθηκε μόνο ο τύπος Α.Το γονίδιο toxA ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 43% στο σύνολο των στελεχών της P. multocida. Στους χοίρους και στα βοοειδή, το ποσοστό ήταν αρκετά χαμηλό (2,3% και 5,3% αντίστοιχα). Αντίθετα, στα στελέχη των μικρών μηρυκαστικών, το ποσοστό ανίχνευσης του γονιδίου ήταν απρόσμενα υψηλό (85,7% στις αίγες και 93,2% στα πρόβατα), γεγονός που εγείρει ερωτήματα, που χρήζουν περαιτέρω έρευνας, σχετικά με τη σημασία της τοξίνης στην παθογένεια και επιδημιολογία των πνευμονικών λοιμώξεων από P. multocida στα συγκεκριμένα είδη ζώων.Η ανάλυση του γονιδίου ompA της P. multocida έδειξε πολύ μεγάλη ετερογένεια των στελεχών, τα οποία κατατάχθηκαν σε 11 συνολικά γονοτυπικές ομάδες. Τόσο με την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA, όσο και με την εφαρμογή πρωτοκόλλου PCR-RFLP, ήταν δυνατή η διάκριση των στελεχών των μηρυκαστικών από τα στελέχη των χοίρων.Μεταξύ των στελεχών της M. haemolytica, ο επικρατέστερος ορότυπος ήταν ο Α2 (47,8% στο σύνολο των στελεχών). Το σύνολο των στελεχών των αιγών και το 36,8% των στελεχών των προβάτων ήταν Α2, ενώ οι λοιποί ορότυποι (Α1-14,5%, Α7-13,2%, Α9-9,2%, Α12-9,2%, Α6-3,9% και Α5-2,6%) βρέθηκαν μόνο μεταξύ των πρόβειων στελεχών. Μάλιστα, στα πρόβατα, σε ποσοστό 11,8% βρέθηκαν ορότυποι που δεν περιλαμβάνονται στα εμβόλια του εμπορίου.Η μελέτη του γονιδίου ompA ανέδειξε εννέα συνολικά γονοτυπικές ομάδες μεταξύ των στελεχών της M. haemolytica. Τα στελέχη των προβάτων έδειξαν μεγαλύτερη ετερογένεια και κατατάχθηκαν σε οκτώ ομάδες, δύο από τις οποίες ήταν οι πολυπληθέστερες. Αντίθετα, η πλειονότητα των στελεχών των αιγών αποτέλεσε μία ξεχωριστή ομάδα, ενώ τα υπόλοιπα στελέχη των αιγών κατατάχθηκαν στις δύο κύριες ομάδες των πρόβειων στελεχών. Η διάκριση της πλειονότητας των στελεχών των αιγών από αυτά των προβάτων ήταν δυνατή και με τη μέθοδο της DGGE.Το γονίδιο lktA ανιχνεύθηκε στο σύνολο των στελεχών της M. haemolytica που εξετάσθηκαν. Τα στελέχη των αιγών κατατάχθηκαν σε δύο γονότυπους, ενώ πέντε διαφορετικοί γονότυποι βρέθηκαν μεταξύ των στελεχών των προβάτων. Η παρουσία πολλών πολυμορφισμών σε συντηρημένες, υδρόφοβες περιοχές του γονιδίου και η μεγαλύτερη πιθανότητα ορισμένες από αλληλουχίες των ελληνικών στελεχών να έχουν το ρόλο MTS (mitochondrial targeting signal) αποτελούν σημαντικά ευρήματα της παρούσας έρευνας που χρήζουν μελλοντικής διερεύνησης.Κατά τη μελέτη των στελεχών, δεν παρατηρήθηκε συγκεκριμένη γεωγραφική κατανομή για κανένα από τα χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν. Αντίθετα, παρατηρήθηκε ετερογένεια ακόμη και μεταξύ στελεχών της ίδιας εκτροφής, η οποία είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη στην επιλογή των στελεχών για την παρασκευή εμβολίων.Η μελέτη του γονιδίου ompA της P. multocida και της M. haemolytica έδειξε ότι συγκεκριμένα αλληλόμορφα φαίνεται να εμφανίζουν ειδικότητα ξενιστή και, επομένως, το γονίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη πρωτοκόλλου ταυτοποίησης στελεχών των δύο ειδών βακτηρίων. Τα ευρήματα της παρούσας έρευνας αποτελούν την πρώτη αναφορά μέχρι σήμερα στη γενετική ποικιλότητα του γονιδίου ompA της P. multocida.