Ανίχνευση Β- και Τ-επιτόπων της θυρεοσφαιρίνης: συσχέτιση με την ανθρώπινη νόσο (θυρεοειδίτιδα Hashimoto) και την πειραματική νόσο στον ποντικό

Abstract

In the context of the current thesis, B- and T- cell epitopes of thyroglobulin (Tg), themain autoantigen in autoimmune thyroiditis, were investigated. The large size of Tgrenders the molecule attractive for extensive epitope studies, recognised by B- andT-cells, but at the same time opposes limitations in the identifications ofimmunodominant regions.B-epitopes: A common denominator among the two main autoimmune thyroiddiseases Hashimoto’s thyroiditis (HT) and Graves’ disease (GD) is the circulation ofTg autoantibodies exploited in the diagnosis, but devoid of a specific pathogenicrole. The correlation of B-cell Tg epitopes and autoimmune thyroid diseases hasbeen thoroughly examined. In an earlier study of the Immunology Laboratory ofHellenic Pasteur Institute a panel of 48 overlapping peptides (overlap by 8 aa)spanning the C-terminal end of Tg, 17 peptides were characterised as targets ofautoimmune antibodies from patients with GD. Three of the above peptides thatpresented with the highest reactivity were studied, per se or mixed, as possibletargets of patients with HT, a hypothesis not verified.In the first part of the thesis new peptide-markers of human Tg were investigated, inorder to serologically differentiate the two autoimmune thyroid diseases, mainlyfocused however in HT. From the available panel of antigenic peptides of theLaboratory, three new peptides, p2208(2208-2227), p2352(2352-2371) andp2472(2472-2491), were selected for their study. When examining whole sera, werepeptides were found to be equally recognised from patients sera of both groups.Only the isolation of total IgG from the sera resulted in statistically significantdifferences of the two clinical entities, mainly when a mixture of the peptides wasutilised. (71% HT and 100% GD, p<0.05). In total, the study points towards theunsuitability of the specific peptides in the clinical practice of HT, but one shouldkeep in mind that the results might be biased from their initial selection as targets ofthe IgG from GD patients.T-epitopes: In order to apprehend the pathogenetic mechanisms that underlie theautoimmune thyroid diseases, suitable experimental animal models of the diseaseshave been developed. Specifically in HT, Experimental Autoimmune Thyroiditis(EAT) serves as a model of study and is induced in mice either directly(immunisation with Tg or Tg peptides), or indirectly (adoptive transfer of Tg-primedmouse lymph node cells). The responsiveness to Tg (thyroid gland cell mononuclearinfiltration, anti-Tg antibody titers) classifies the animals in high (HR) and low (LR)EAT responders, a characteristic associated with their H-2 haplotype; H-2k, H-2s andH-2q for HR – the latter of intermediate susceptibility – and H-2b, H-2d and H-2v forLR. Throughout the last 20 years, studies on the pathogenic mechanisms of EAThave been described almost exclusively from HR wild type mouse strains. Out of the34 peptides examined in these strains 17 were thyroiditogenic, whereas out of the10 peptides examined in LR wild type mouse strains only one, the 20-mer p2340(a.a. 2340-2359), was able to induce EAT. The peptide was characterised through aprevious study of the Immunology Laboratory of Hellenic Pasteur Institute, aspathogenic to the LR strains C57BL/6 (H-2b) and BALB/c (H-2d) via the adoptivetransfer of syngeneic peptide-primed LNCs, and to HR strains SJL/J (H-2s) andCBA/J (H-2k) by direct challenge. It is therefore prominent that the lack of adequateknowledge on pathogenic peptides on LR mouse strains, hampers the study andcomparison of the disease mechanisms in these two types of mice.The goal of the second part of the thesis was the identification of new pathogenic20mer Tg peptides that are able to induce direct EAT in LR mouse strains. Throughthe use of the available panel of the 48 peptides of the Laboratory, two newpeptides were identified, p2208 (2208-2227) and p2352 (2352-2371), that werepredicted to contain overlapping binding motifs to HR MHC molecules. P2208 wasof particular interest, since it contained additional binding motifs to LR MHCmolecules. The direct administration in two HR and two LR strains of p2208revealed its immunogenic and pathogenic nature in one HR (SJL/J) and one LR(C57BL/6) mouse strain. It was additionally found to bear cryptic epitope/s within itssequence. It is the first time that a peptide is reported to induce direct EAT withextensive infiltration of the thyroid gland of HR, as well as LR strains. Moreover, theimmunisation of mice with p2208 resulted in the production of specific antibodies,not only against the immunising antigen, but also against the intact Tg. This propertysuggests that the peptide either carries a surface, accessible epitope on the tertiarystructure of Tg, or induces intramolecular epitope spreading. The removal of thespecific antibodies from the mice anti-sera that resulted in the dramatic decrease ofthe Tg-reactivity supported the first hypothesis.Finally, the second peptide that emerged from the in silico analysis, p2352, was notfound to be immunogenic, nor pathogenic in the examined mouse strains.Overall, from our effort to identify new antigenic determinants of Tg in a B- and Tcellularlevel the following conclusions can be drawn:a) the use of small (20mer) peptides might not be appropriate for the identification ofspecific antibody subpopulations of diagnostic value in the total sera of patients withautoimmune thyroid disease.b) peptide p2208 possesses the unique ability to induce direct EAT in LR mousestrains. Such an experimental EAT model is ideal for the investigation of themechanisms that generate resistance in its expression.c) the identification of B-, and T-epitopes on the peptide p2208, as well as its abilityto induce direct EAT in HR and LR mouse strains, imposes the assessment of theminimal responsible amino acid sequence/position of the different epitopes on thepeptide.

Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκαν νέοι Β- και Τ- επίτοποι της θυρεοσφαιρίνης(Tg), του κύριου αυτοαντιγόνου στην αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα. Η Tg, λόγω τουμεγάλου μεγέθους της, προσφέρεται για εκτενείς μελέτες εντοπισμού επιτόπων πουαναγνωρίζονται από Β- και Τ-κύτταρα, αλλά αυτός είναι και ο κύριος λόγος πουδυσχεραίνεται ο προσδιορισμός ανοσο-επικρατουσών περιοχών.Β-επίτοποι: Κοινός παρονομαστής στις δύο κύριες αυτοάνοσες παθήσεις τουθυρεοειδή αδένα [θυρεοειδίτιδα Hashimoto (Hashimoto’s thyroiditis-HT) και νόσοςGraves’ (Graves’ disease-GD)] είναι κυκλοφορούντα αντι-Tg αυτοαντισώματα,αξιόλογα στη διάγνωση, δίχως όμως κυρίαρχο παθογονικό ρόλο. Η συσχέτιση Β-επιτόπων της Tg και αυτοάνοσων θυρεοειδικών ασθενειών δεν έχει αποτελέσεισυχνά αντικείμενο έρευνας. Σε παλαιότερη μελέτη του Εργαστηρίου Ανοσολογίαςτου Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, με βάση ένα πάνελ 48 αλληλεπικαλυπτόμενωνσυνθετικών πεπτιδίων (επικάλυψη 8 αμινοξέων) της καρβοξυ-τελικής περιοχής τηςTg, είχαν χαρακτηριστεί 17 που αποτελούσαν στόχο αυτοαντισωμάτων απόασθενείς με GD. Τα τρία που αναγνωρίστηκαν πιο ισχυρά, μελετήθηκαν στησυνέχεια, αναμεμειγμένα ή μη, ως πιθανοί στόχοι και των αυτοαντισωμάτων απόασθενείς με HT, πράγμα που δεν επιβεβαιώθηκε.Στο πρώτο μέρος της διατριβής διερευνήθηκαν νέα πεπτίδια-δείκτες τηςανθρώπινης Tg, με σκοπό τον ορολογικό διαχωρισμό των δύο αυτοάνοσωνθυρεοειδικών ασθενειών, και κυρίως για την επιλεκτική ορολογική διάγνωση της HT.Από το διαθέσιμο πάνελ των αντιγονικών πεπτιδίων του Εργαστηρίου επιλέχθηκανπρος μελέτη τρία νέα, το p2208(2208-2227), το p2352(2352-2371) και τοp2472(2472-2491). Σε επίπεδο ολικού ορού βρέθηκε πως τα πεπτίδια της μελέτηςαναγνωρίζονταν εξίσου από τους ορούς και των δύο ομάδων ασθενών. Μόνο ότανχρησιμοποιήθηκαν απομονωμένες ολικές IgG των ορών παρατηρήθηκε στατιστικάσημαντική ορολογική διαφοροποίηση των δύο κλινικών οντοτήτων, κυρίως όταν ταπεπτίδια χρησιμοποιούνται αναμεμειγμένα (71% HT και 100% GD, p<0.05).Συμπερασματικά, η μελέτη καταδεικνύει την ακαταλληλότητα των εν λόγω πεπτιδίωνστη διαγνωστική πρακτική της HT, όμως θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότιενδεχομένως τα αποτελέσματα έχουν επηρεαστεί από τον αρχικό τρόπο επιλογήςτους, που βασίστηκε στην αναγνώρισή τους από τις IgG ασθενών με GD.Τ-επίτοποι: Για την κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που διέπουν τιςαυτοάνοσες θυρεοειδικές ασθένειες, απαιτείται η δημιουργία κατάλληλωνπειραματικών ζωικών προτύπων. Ειδικότερα για τη ΗΤ, το πρότυπο μελέτης είναι ηπειραματική αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα (ΕΑΤ), η οποία επάγεται στον ποντικό είτεάμεσα (ανοσοποίηση με Tg ή πεπτίδια αυτής παρουσία ανοσοενισχυτικού), είτεέμμεσα (παθητική μεταφορά in vivo και in vitro ενεργοποιημένων με Tg κυττάρωναπό λεμφαδένες ποντικών). Η βαρύτητα εκδήλωσης της νόσου (διήθηση θυρεοειδήαδένα από μονοπύρηνα κύτταρα, παραγωγή ειδικών αντι-Tg αντισωμάτων)κατατάσσει τα ζώα σε ευαίσθητα (high responder-HR) και ανθεκτικά (low responder-LR), μία ιδιότητα που συνδέεται με τον απλότυπο των μορίων MHC τάξης II πουφέρουν: Η2k, H2q, H2s για τα HR και H2b, H2d, H2v για τα LR. Τα τελευταία 20χρόνια, οι μελέτες γύρω από τους παθογενετικούς μηχανισμούς της ΕΑΤπροέρχονται σχεδόν αποκλειστικά από τη χρήση στελεχών HR αγρίου τύπουποντικών. Από τα 34 πεπτίδια που έχουν δοκιμαστεί στις φυλές αυτές, τα 17 είναιπαθογονικά, ενώ από τα 10 πεπτίδια που έχουν δοκιμαστεί σε στελέχη LR αγρίουτύπου, μόνο ένα επάγει ΕΑΤ, το 20μερές p2340 (2340-2359). Το πεπτίδιο αυτόχαρακτηρίστηκε, σε προηγούμενη μελέτη του Εργαστηρίου Ανοσολογίας τουΕλληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, ως παθογονικό στις φυλές LR ποντικών C57BL/6(H-2b) και BALB/c (H-2d) μόνο μετά από παθητική μεταφορά in vivo και in vitroενεργοποιημένων με το πεπτίδιο λεμφοκυττάρων ποντικών, ενώ στις φυλές HRSJL/J (H-2s) και CBA/J (H-2k) με άμεση ανοσοποίηση. Είναι λοιπόν προφανές, ότι ηέλλειψη επαρκούς γνώσης σχετικά με παθογονικά πεπτίδια στις φυλές LR ποντικώνδεν επιτρέπει τη σύγκριση και κατανόηση των μηχανισμών παθογένειας των δύοτύπων ποντικών.Σκοπός του δεύτερου μέρους της διατριβής ήταν ο εντοπισμός νέων παθογονικών20μερών πεπτιδίων της Tg με ικανότητα επαγωγής ΕΑΤ σε LR φυλές. Με τη χρήσητου διαθέσιμου πάνελ των 48 πεπτιδίων του Εργαστηρίου, εντοπίστηκαν δύο νέαπεπτίδια, το p2208 (2208-2227) και το p2352 (2352-2371), τα οποία περιείχαναλληλεπικαλυπτόμενα μοτίβα πρόσδεσης σε μόρια MHC HR ποντικών. Το p2208παρουσίασε ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς έφερε επιπλέον μοτίβα πρόσδεσης σεμόρια MHC LR ποντικών. Μετά από την άμεση χορήγησή του σε δύο HR και δύο LRφυλές, το p2208 βρέθηκε ανοσογονικό και παθογονικό σε μία HR (SJL/J) και σε μίαLR (C57BL/6) φυλή ποντικών. Επιπλέον, έφερε κρυπτικό/ούς επίτοπο/ους στηναλληλουχία του. Είναι η πρώτη φορά που ένα πεπτίδιο αναφέρεται να επάγει άμεσηΕΑΤ με εκτενή διήθηση του αδένα τόσο στη φυλή HR και όσο και στη φυλή LR.Επιπρόσθετα, η ανοσοποίηση των ποντικών με το p2208 είχε ως αποτέλεσμα τηνπαραγωγή ειδικών αντισωμάτων, όχι μόνο έναντι του πεπτιδίου, αλλά καιολόκληρης της Tg. Η ιδιότητά τους αυτή, υποδηλώνει ότι το πεπτίδιο είτε φέρει ένανεπιφανειακό, προσβάσιμο επίτοπο στην τεταρτοταγή δομή της Tg, είτε επάγειενδομοριακή επέκταση επιτόπων. Η απομάκρυνση των ειδικών αντισωμάτων απότους αντι-ορούς ποντικών που είχε ως αποτέλεσμα τη δραματική μείωση τηςδραστικότητας έναντι της Tg, υποστηρίζει την πρώτη ερμηνεία.Τέλος, το δεύτερο πεπτίδιο που ανέδειξε η in silico ανάλυση, το p2352, δεν βρέθηκεανοσογονικό ή παθογονικό σε καμία από τις φυλές ποντικών όπου ελέγχθηκε.Συνολικά, από την προσπάθεια εντοπισμού νέων αντιγονικών καθοριστών της Tgσε επίπεδο Β- και Τ-κυττάρων εξάγονται τα εξής συμπεράσματα:α) η χρήση μικρών (20μερών) πεπτιδίων ενδεχομένως να μην ενδείκνυται για τονεντοπισμό ειδικών πληθυσμών αντισωμάτων με διαγνωστική αξία στον ολικό ορόασθενών με αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα.β) το πεπτίδιο p2208 φέρει μοναδική ικανότητα να επάγει άμεση ΕΑΤ σε LR στελέχηποντικών. Ένα τέτοιο πειραματικό μοντέλο της ΕΑΤ προσφέρεται για τη διερεύνησητων μηχανισμών που προσδίδουν ανθεκτικότητα στην εκδήλωσή της.γ) ο εντοπισμός Β- αλλά και Τ-επιτόπων στο πεπτίδιο p2208, καθώς και η ικανότητάτου να επάγει άμεση ΕΑΤ σε HR και LR φυλές ποντικών, καθιστά αναγκαίο τονπροσδιορισμό της ελάχιστης αμινοξικής αλληλουχίας/θέσης των διαφορετικώνεπιτόπων στο πεπτίδιο.