Χρήση των ταχυζωιδίων του Toxoplasma gondii για τον λειτουργικό έλεγχο φυσικών ή μοριακά τροποποιημένων αναστολέων της υπεροικογένειας των σερπινών-Διερεύνηση της δυνατότητας της χρήσης των σερπινών ως αντιπαρασιτικών ουσιών

Abstract

Proteases have been shown to participate in vital processes of Apicomplexa parasites. Since parasite survival as well as host-parasite interactions have been linked with serine proteinases, extensive research has been focused on this family of proteases the last years. All evidences indicate that this family of proteinases is of particular interest not only for their biological function, but also as potential targets for drug design.However, the essential role of proteases in parasite physiology and interactions with its host cells as well as the haploid nature of parasite’s genome for most of its life cycle very often complicate their functional analysis. A lot of attempts to disrupt specific serine proteinases genes in Plasmodium spp and in Toxoplasma have been unsuccessful. In addition, studies to purify recombinant functional parasitic proteolytic enzymes, most of the times, fail as well. Furthermore, other studies indicate that usage of chemical protease inhibitors has been proven disadvantageous because of the wide range of their function. That is why alternative approaches have to be developed in order to study essential parasitic proteases.Since macromolecular protease inhibitors (MPIs) are natural inhibitors of proteases and strongly interact with their targets in this study is proposed the usage of MPIs as tools in order to inactivate parasitic proteases and assign in vivo functions for these molecules. Based on this approach we have created a collection of native and molecular engineered MPIs with specificity against serine proteases in order to target serine proteases of Τ. gondii.The project objectives were to generate and characterize transgenic tachyzoites deficient for proteolysis by expressing in vivo MPIs in order to unravel the role of proteolysis and/or the role of specific proteases in critical developmental stages. Our strategy is mainly a phenotype-based approach were through the construction of genetically modified tachyzoites expressing MPIs, a collection of these molecules can be screened for the identification of those that affect a particular biological process. In addition, MPIs have been used to develop a similar target-based approach by guiding them to specific cellular compartments of the parasite such as micronemes in order to target proteases that have been localized in the same cellular compartments.The in vivo expression of MPIs in parasites and the characterization of the transgenic strains that have been constructed allowed the functional evaluation of MPIs as antiparasitic agents and helped to explore the parasite itself as a test tube in order to set up high through put studies for the identification of additional MPIs against parasitic proteases.

Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες µελέτες υποδεικνύουν την κρίσιµη σηµασία της πρωτεόλυσης στα είδη του φύλου των Apicomplexa. Οι παρασιτικές πρωτεάσες εµπλέκονται σε πολύ εξειδικευµένες λειτουργίες των παράσιτων σηµαντικές για την επιβίωση του οργανισµού καθώς και σε διεργασίες που αφορούν την αλληλεπίδραση του µε τα κύτταρα του ξενιστή. Συνολικά, ο κρίσιµος ρόλος των πρωτεασών στους µηχανισµούς εισβολής των κυττάρων, στον εξειδικευµένοµεταβολισµό του παρασίτου, στην αποφυγή του ανοσοποιητικού συστήµατος του ξενιστή, στον µηχανισµό εξόδου από το κύτταρο, στην παθογονικότητα, στην αύξηση καθώς και στην ανάπτυξη του παρασίτου έχουν µετατρέψει τα µόρια αυτά σε σηµαντικούς φαρµακευτικούς στόχους.Ανάµεσα στις πρωτεάσες που ερευνώνται εντατικά στα Apicomplexa είναιµέλη της οικογένειας των πρωτεασών σερίνης. Ωστόσο, ο κρίσιµος ρόλος των µορίων αυτών στην φυσιολογία των παρασίτων και στις αλληλεπιδράσεις του µε τα κύτταρα του ξενιστή καθώς επίσης και το απλοειδές γονιδίωµα του παρασίτου για τονµεγαλύτερο µέρος του κύκλου ζωής του, συχνά περιπλέκουν τη λειτουργική ανάλυση τους. Για αυτούς τους λόγους πολλές προσπάθειες διαγραφής γονιδίων πρωτεασών σερίνης από το γένωµα των παρασίτων, όπως επίσης και έκφραση ανασυνδυασµένων λειτουργικών µορίων για τον βιοχηµικό χαρακτηρισµό τους έχουν αποτύχει επανειληµµένα. Επιπλέον, από άλλες µελέτες υποδεικνύεται ότι η χρήση χηµικών αναστολέων πρωτεασών µειονεκτεί σηµαντικά λόγω του µεγάλου εύρους δράσης τους. Για αυτό το λόγο κρίνεται απαραίτητο να αναπτυχθούν εναλλακτικές προσεγγίσεις απενεργοποίησης της λειτουργίας των κρίσιµων πρωτεασών για την επιβίωση του παρασίτου προκειµένου να επιτευχθεί η µελέτη τους.Στην εργασία αυτή προτείνεται η χρήση πεπτιδικών αναστολέων πρωτεάσεων (macromolecular protease inhibitors, MPIs) ως εργαλεία προκειµένου να παρεµποδιστούν in vivo οι λειτουργίες παρασιτικών πρωτεασών. Βάση της προσέγγισης αυτής έχει δηµιουργηθεί µία συλλογή από φυσικά και µοριακά τροποποιηµένους αναστολείς πρωτεασών σερίνης προκειµένου να στοχεύθουν τα αντίστοιχα πρωτεολυτικά µόρια του Τ. gondii. Τα MPIs µόρια συνήθως ρυθµίζουν κρίσιµα πρωτεολυτικά φαινόµενα απενεργοποιώντας πρωτεάσες. Η εκτεθειµένη λούπα αλληλεπίδρασης του αναστολέα αναγνωρίζεται από την πρωτεάση στόχο καθώς µιµείται δοµικά το υπόστρωµα των πρωτεασών στόχων. Γεγονός, που ενισχύει την χρήση των µορίων αυτών ως εργαλεία στην µελέτη αυτή είναι το ότι έχουν υπάρξει βιβλιογραφικές αναφορές εξειδικευµένης αναστολής, από φυσικά αποµονωµένους ή τροποποιηµένους αναστολείς που χρησιµοποιήθηκαν για την αντιµετώπιση µολυσµατικών ασθενειών.Συνολικά σε αυτή την διατριβή παρουσιάζεται η in vivo έκφραση µοριακά τροποποιηµένων ή φυσικά αποµονοµένων µορίων MPIs στο Toxoplasma gondii προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η απενεργοποίηση πρωτεολυτικών τροποποιήσεων στο αναπτυξιακό στάδιο του ταχυζωιδίου. Επιπλέον, λόγω του καλύτερου χαρακτηρισµού του εκκριτικού µονοπατιού στο είδος αυτό πραγµατοποιήθηκαν προσπάθειες στόχευσης των µικρονηµατίων, εξειδικευµένων εκκριτικών οργανιδίων που παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον µηχανισµό της εισβολής των παρασίτων ως προσπάθεια στόχευσης των πρωτεολυτικών µονοπάτιων των µικρονηµατίων κατά την εισβολή του παρασίτου στα κύτταρα.Όλοι οι αναστολείς επιλέχθηκαν ως πιθανοί αναστολείς παρασιτικών πρωτεασών σερίνης και χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή διαγονιδιακών στελεχών τα οποία έκφραζαν τα µόρια αυτά µέσα στο εκκριτικό µονοπάτι του παρασίτου. Η in vivo έκφραση αυτών των MPIs µορίων και ο χαρακτηρισµός των διαγονιδιακών στελεχών που κατασκευάστηκαν επέτρεψε τον λειτουργικό έλεγχο των ΜΡΙs ως αντιπαρασιτικά µόρια και έθεσε τις βάσεις για την ανάπτυξη µελετώνµεγάλης εµβέλειας προεκειµένου να ανιχνευθούν επιπρόσθετα εξειδικευµένοι ΜPIs αναστολείς έναντι κρίσιµων παρασιτικών πρωτεασών.