Βιοχημική και μοριακή ανάλυση του μηχανισμού συζευκτικής κινητοποίησης του πλασμιδίου ColE1

Abstract

MbeA is a 60 kDa protein encoded by plasmid ColEl. It plays a key role in conjugative mobilization. MbeA*, a slightly truncated version o f MbeA, it was overproduced and purified for in vitro analysis. MbeA* catalyzed DNA cleavage and strand-transfer reactions using oligonucleotides embracing the ColEl nic site. Furthermore, C olEl nic site was precisely mapped to 5'-(1462)TAAG/CCAG(1469)-3'. Our analysis thus demonstrates that MbeA is the relaxase for ColEl conjugal mobilization, in spite that MbeA lacks a three histidine motif considered the invariant signature of conjugative relaxases. Amino acid sequence comparisons suggest MbeA is nevertheless related to the common relaxase protein family. For instance, MbeA residue Y19 could correspond to the invariant tyrosine in M otif I, whereas H97, E l04 and N106 may constitute the equivalent residues to the histidine triad in M otif HI. This hypothesis was tested by site-directed mutagenesis. MbeA amino acid residues Y19, H97, E l04 and N106 were changed to alanine. MbeA mutant N106A showed reduced oligonucleotide cleavage and strand-transfer activities, while mutation in either o f the other three residues resulted in proteins without detectable activity. Mutant N106A also exhibited reduced oligonucleotide binding capacity, while this property was not significantly affected in the other mutants. Thus, N106 is primarily involved in MbeA binding to the nic site, while Y19, H97 and E104 seem to be directly implicated in catalysis o f DNA-cleavage and strand-transfer reactions. Adouble substitution o f E104 and N106 by histidines, therefore reconstituting the canonical histidine triad, restored relaxase activities to 1% of wild type. The above results confirm our hypothesis that MbeA is a variant o f the common relaxase theme with a HEN signature motif, which has to be added to the canonical three histidine m otif o f previously reported relaxases.

Η MbeA είναι μια πρωτεΐνη μεγέθους 60 kDa, η οποία κωδικοποιείται από το πλασμίδιο ColEl και παίζει σημαντικό ρόλο στη συζευκτική κινητοποίηση του πλασμιδίου αυτού. Η πρωτεΐνη MbeA* είναι μια «κολλοβή» μορφή της MbeA, η οποία υπερεκφράστηκε, απομονώθηκε σε καθαρή μορφή και χρησιμοποιήθηκε για in vitro ανάλυση. Η MbeA* καταλύει σχάση και μεταφορά αλυσίδας μονόκλωνουDNA. Τα αποτελέσματα λοιπόν αυτής της εργασίας υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη MbeA είναι η ριλαξάση του πλασμιδίου ColEl, παρόλο που δεν παρουσιάζει στην αλληλουχία της το μοτίβο των 3Η. Σύγκριση της αλληλουχίας των αμινοξέων της MbeA, υποδεικνύει ότι έχει αρκετές ομοιότητες με τις ριλαξάσες που έχουν χαρακτηρισθεί μέχρι στιγμής. Για παράδειγμα, η Υ19 της MbeA θα μπορούσε νααντιστοιχεί στην τυροσίνη του μοτίβου I των ριλαξασών, ενώ τα Η97, Ε104 και Ν106, θα μπορούσαν να αντιστοιχούν σε εναλλακτικό μοτίβο ΠΙ. Αυτή η υπόθεση αναλύθηκε με κατευθυνόμενη μεταλλαξηγέννεση σημείου των αμινοξέων Υ19, Η97, Ε104 και Ν106. Η βιοχημική μελέτη των μεταλλαγμάτων έδειξε ότι η ριλαξάση MbeA του πλασμιδίου ColEl παρουσιάζει το εναλλακτικό μοτίβο ΗΕΝ και όχι το μοτίβο των 3Η, το οποίο θεωρείται η αναγνωριστική αλληλουχία των ριλαξασών.