Μελέτη εξωκυτταρικών πρωτεϊνασών από ψυχρότροφα βακτήρια γάλακτος

Abstract

Μελετήθηκε η εξωκυτταρική πρωτεϊνάση του στελέχους Pseudomonas fluorescens TR2 και το εξωκυτταρικό παρασκεύασμα πρωτεΐνάσης του στελέχους Flavobacterium spp. MTR3, ψυχρότροφα στελέχη που απομονώθηκαν από νωπό γάλα. Η εξωκυτταρική πρωτεϊνάση του στελέχους Ρ. fluorescens TR2 καθαρίστηκε σε επίπεδο ηλεκτροφορητικής ομοιογένειας . Είχε μοριακό βάρος43,5kDa και περιείχε lgrat Zn ανά mole. Το ένζυμο αναστελλόταν με EDTA και 1,10 φαινανθρολίνη, ενώ το αποένζυμο επανενεργοποιούνταν με προσθήκη Zn. Η πρωτεϊνάση παρουσίαζε μεγαλύτερη δραστικότητα στους περίπου 37°C και pH 7,0, ενώ ήταν δραστική στους 7°C και σε pH 6,0 παρουσία 4% (w/v) NaCl. Το ένζυμο ήταν ασταθές σε υψηλές θερμοκρασίες (>90 - 100°C ), ενώ ήταν πολύ θερμοανθεκτικό σε αυτές τις θερμοκρασίες παρουσία Ca2+. Με θέρμανση στους 60°C, κατά την οποία παρατηρούνταν αύξηση στη φαινόμενη υδροφοβία, το ένζυμο αυτολυόταν. Κατά την θέρμανση στους 60°C παρουσία καζεΐνης παρατηρήθηκε μια αναστολή της αυτόλυσης, ενώ η πρωτεϊνάση ήταν δραστική κα\ . υδρόλυε την καζεΐνη. Η τιμή Km της πρωτεΐνάσης του Ρ. fluorescens TR2 με υπόστρωμα την ολική καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος ήταν l,7mg/ml. Παρουσίαζε δραστικότητα αυστηρά ενδοπεπτιδάσης, χωρίς αμινοπεπτιδασική δραστικότητα. Το ένζυμουδρόλυε τις β - και as - καζεΐνες αγελαδινού και πρόβειου γάλακτος, ταχύτερα την β - καζεΐνη. Επίσης, υδρόλυε το πεπτίδιο asi - CN f 1 — 23 (είτε τουλάχιστον ανάλογά του) αλλά και πεπτίδια που προέκυπταν με την υδρόλυσή του. Όπως παρακολουθήθηκε ηλεκτροφορητικά, η πρωτεϊνάση υδρόλυε μεγάλα πεπτίδια υδατικού εκχυλίσματος αγελαδινού και πρόβειου τυριού. Επίσης, όπωςπαρακολουθήθηκε με υγρή χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, το ένζυμο υδρόλυε κατά προτίμηση υδρόφοβα πεπτίδια υδατικού εκχυλίσματος αγελαδινού και πρόβειου τυρού. Με βάση την υδρόλυση των υποστρωμάτων προκύπτει ότι η πρωτεϊνάση του Ρ. fluorescens TR2 είναι πιθανόν κατάλληλη για αποπίκρανση και επιτάχυνση ωρίμανσης τυριών. Το εξωκυτταρικό παρασκεύασμα πρωτέϊνάσης του Flavobacterium spp. MTR3 καθαρίστηκε μόνο μερικώς. Το ενζυμικό παρασκεύασμα παρουσίαζε μεγαλύτερη δραστικότητα στους 45°C και pH 8,0, ενώ ήταν επίσης πολύ δραστικό στους 7°C και σε pH 6,0 παρουσία 4% (w/v) NaCl. Το παρασκεύασμα πρωτέϊνάσης έχανε πάνω από το 90% τηςδραστικότητάς του με θερμικές κατεργασίες πάνω από τους 65°C, ακόμη και παρουσία Ca2+. Η τιμή Km του παρασκευάσματος πρωτέϊνάσης του Flavobacterium spp. MTR3 με υπόστρωμα την ολική καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος ήταν l,3mg/ml. Το παρασκεύασμα υδρόλυε τις β - και as - καζεΐνες αγελαδινού και πρόβειου γάλακτος, ταχύτερα την β - καζεΐνη. Επίσης, σε κάποιο βαθμό υδρόλυε πεπτίδια αγελαδινών και πρόβειων τυριών. Το παρασκεύασμα πρωτέϊνάσης του Flavobacterium spp. MTR3 παρουσίαζε δραστικότητα αμινοπεπτιδάσης, ιδιαίτερα αμινοπεπτιδάσης λεύκινης.