Απόκριση κυττάρων HeLa σε μόλυνση με ιούς γρίπης τύπου Β και Α: πιθανές προεκτάσεις στη βιολογική αντιμετώπιση της ανθρώπινης ασθένειας

Abstract

Acquired genetic reprogramming of normal cellular activities is rapidly recognized as a common cause of human disease with cancer, a life threatening condition, being the most representative member of this disease group. Attempts to reverse or correct the altered genetic program oftransformed cells by biophysical or biochemical methods have been inconclusive, most likely because of the complex multistage and multifactorial nature of the cancer state. In line to basic biological guidelines suggesting that all biological problems must have biological solution(s), anentirely biological corrective approach to cancer and this disease group accordingly was exploited, by assessing the effect of non-oncogenic viruses on receptive cancer cells. For this purpose, human adenocarcinoma cells (HeLa) carrying 20 copies of the high risk human papiloma virus-18 strain(HPV-18) stably integrated in their genome and expressing appropriate viral receptors, were infected independently with influenza B (IBV) & A (IAV) viral strains and compared the morphologic, marker antigen expression and divisional properties of surviving hosts to those of normal primary endocervical adenoepithelial cells and uninfected HeLa cell controls byPapanikolaou-staining and immunocytochemistry. This comparison revealed that normal primary endocervical and infected HeLa cells surviving infection shared similar morphologic, phenotypic and divisional patterns, which differed drastically from those of uninfected HeLa cells. The number of viable infected hosts at seven days post infection did not change during a three week follow-up period and their cyclin E levels suggested that they had been arrested to the G1 phase of the cell cycle by viral stress. These findings suggested that in addition to apoptosis, non-oncogenic viral stress activated expression of endocervical metaplastic-like motifs to surviving hosts. A mechanism of adoptive replacement of conditional cellular with viral gene expression was proposed to collectively account for these observations. To test directly this working hypothesis, HeLa cells were infected with low (10'9 units), medium (1CT6 units) and high (10~2 units) IBV titers and theresulting HPV, retinoic acid receptor a subunit (RARa) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA content of surviving infected hosts 10 days post-infection was compared to that of their uninfected precursors by semi-quantitative reverse ranscriptase/polymerase chain reaction amplification (RT/PCR). This comparison revealed moderate and drastic dependence of HPV and RARa mRNA content respectively, while complete independence of GAPDH mRNA expression, on viral titer. Suppression of conditional gene expression of dispensable products like HPV and RARa, in cell remnants surviving non-oncogenic viral stress, apparently rescued the cells from apoptosis by allowing them to support viralantigen expression. These observations provided direct support to the proposed mechanism of adaptive replacement of conditional cellular with viral gene expression as the basis for the observed differential susceptibility of viral receptor-expressing normal and cancer cells to non-oncogenicviruses. In conclusion this study described a mechanism of elimination / correction of receptive cancer cells by appropriate non-oncogenic viral stress, that bears promise for a broad range of biomedical applications on the improved management of human disease including directly responsive types of cancer, by entirely biological means.

Ο επίκτητος γενετικός επαναπρογραμματισμός των φυσιολογικών κυτταρικών λειτουργειών έχει αναγνωρισθεί ως μια συνήθη αιτία των ανθρώπινων ασθενειών, ιδιαίτερα του καρκίνου που αποτελεί απειλητική κατάσταση για τη ζωή. Προσπάθειες να αναστραφεί ή και να επιδιορθωθεί το παθολογικό γενετικό πρόγραμμα των καρκινικών κυττάρων με βιοφυσικές και βιοχημικές μεθόδους δεν απέδωσαν μέχρι στιγμής τα αναμενόμενα αποτελέσματα, πιθανώς λόγω της σύνθετης πολυπαραγοντικής και πολυσταδιακής φύσης του καρκίνου. Σύμφωνα με το βασικό βιολογικό αξίωμα που υποστηρίζει ότι «όλα τα βιολογικά προβλήματα πρέπει να έχουν και τις βιολογικές λύσεις» επιχειρήθηκε μια εξ’ ολοκλήρου βιολογική διορθωτική προσέγγιση του καρκίνου, μέσω της επίδρασης μη ογκογόνων ιών σε δεκτικά καρκινικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό ανθρώπινα αδενοκαρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας (HeLa), που έφεραν 20 αντίγραφα του στελέχους υψηλού κινδύνου HPV-18 σταθερά ενσωματωμένο στο γενετικό τους υλικό και εξέφραζαν κατάλληλους ιϊκούς υποδοχείς, μολύνθηκαν ανεξάρτητα με στελέχη ιού γρίπης Β και Α. Συγκρίθηκαν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά, οι δείκτες αντιγονικής έκφρασης και οι δυνατότητες διαίρεσης των κυττάρων ξενιστών που επιβίωσαν της μόλυνσης, με αυτές των φυσιολογικών πρωτογενών κυττάρων του ενδοτραχήλου της μήτρας και των μη μολυσμένων HeLa μαρτύρων με χρώση Παπανικολάου και ανοσοκυτταροχημεία. Αυτή η σύγκριση αποκάλυψε ότι τα φυσιολογικά πρωτογενή ενδοτραχηλικά και τα μολυσμένα κύτταρα HeLa που επιβίωσαν της μόλυνσης, μοιράζονται παρόμοια μορφολογικά, φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και διαδικασίες διαίρεσης, ενώ διαφέρουν δραστικά από αυτές των μη μολυσμένων κυττάρων HeLa. Ο αριθμός των κυττάρων ξενιστών που επιβίωσαν 7 ημέρες μετά τη μόλυνση, δεν άλλαξε κατά τη διάρκεια μιας περιόδου παρακολούθησης 3 εβδομάδων ενώ τα επίπεδα της κυκλίνης έδειξαν ότι τα κύτταρα σταμάτησαν στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου λόγω του ιϊκού στρες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι επιπροσθέτως της απόπτωσης το μη ογκογόνο ιϊκό στρες επέφερε αλλαγές στα κύτταρα HeLa που επέζησαν της ιϊκής λοίμωξης διαφοροποιώντας τα δραστικά από τα μη μολυσμένα HeLa και εμφάνισαν έντονες φαινοτυπικές ομοιότητες με τα πρωτογενή και μεταπλαστικά αδενικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Ένας μηχανισμός προσαρμοστικής αντικατάστασης της γονιδιακής έκφρασης των μη απολύτως απαραίτητων για την κυτταρική επιβίωση γονιδιακών συστημάτων προτάθηκε για να εξηγήσει συνολικά αυτές τις παρατηρήσεις. Για να εξετάσουμε άμεσα την υπόθεση εργασίας κύτταρα HeLa μολύνθηκαν με χαμηλό(10'9 μονάδες ), μέσο(10"6 ) και υψηλό τίτλο(10'2) ιού γρίπης τύπου Β και τα περιεχόμενα mRNA του HPV της υπομονάδας α του υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος (RARa) και του γλυκολυτικού ενζύμου glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase(GAPDH), των κυττάρων ξενιστών που επιβίωσαν της μόλυνσης 10 ημέρες μετά, συγκρίθηκαν με αυτά των μη μολυσμένων πρωτογενών κυττάρων με ημιποσοτική RT/PCR (αντίστροφη τρανσκριπτάση). Αυτή η σύγκριση αποκάλυψε μέτρια και δραστική εξάρτηση του περιεχομένου mRNA του HPV και RARa αντίστοιχα, ενώ απεκάλυψε πλήρη ανεξαρτησία της έκφρασης του mRNA του GAPDH αντίστοιχα ως προς τον ιϊκό τίτλο. Καταστολή της υπάρχουσας γονιδιακής έκφρασης των μη απαραίτητων γονιδίων για την επιβίωση όπως του HPV και RARa στα κύτταρα που επιβίωσαν από το στρες με μη ογκογόνο ιό, προφανώς διέσωσε αυτά από απόπτωση, επιτρέποντάς τα να υποστηρίξουν την έκφραση ιϊκών αντιγόνων. Αυτές οι παρατηρήσεις παρείχαν άμεση υποστήριξη του προτεινόμενου μηχανισμού της προσαρμοστικής αντικατάστασης της γονιδιακής έκφρασης με την έκφραση ιϊκών γονιδίων ως τη βάση για την παρατηρούμενη διαφορετική ευαισθησία των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε ιϊκούς υποδοχείς για τους μη ογκογόνους ιούς. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη περιέγραψε ένα μηχανισμό εξάλειψης/ επιδιόρθωσης των δεκτικών καρκινικών κυττάρων από κατάλληλο μη ογκογόνο ιϊκό στρες εξηγώντας τα ευρήματά μας από το απλό μοντέλο: «μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα (HeLa) - μη ογκογόνοι ιοί (γρίπης τύπου Β & Α)», που πιθανώς υπόσχεται κλινικές εφαρμογές για καλύτερη αντιμετώπιση των ανθρώπινων ασθενειών περιλαμβανομένων και των δεκτικών καρκίνων με καθαρά βιολογικά μέσα.