Μελέτη των χρωματοφόρων κυττάρων στο φαγκρί (Pagrus pagrus)

Abstract

Chromatophores (melanophores, xanthophores, erythrophores, leucophores, iridophores, cyanophores) are the basis of the integumentary coloration in fish. They enable fish to change their coloration either through changes in their morphology and density (morphological color change), or through changes in the motility of their chromatosomes (physiological color change). Colour change of fish is controlled by both endogenous (nervous, endocrine) and exogenous (environmental) parameters. Red porgy, Pagrus pagrus, candidate for aquaculture, presents a number ofadvantages for studying the regulation of skin colour since it develops, under intensive rearing, a dark body coloration as opposed to the aesthetically pink colour of wild caught fish. The aim of the present dissertation was to investigate the basis of this difference through (i) qualitative and quantitative study of chromatophores, (ii) identification of the regulatory mechanisms involved in the control of melanophores' motility, and (iii) determination of melanophores' ontogenesis. In order to quantify the morphological differences between reared and wild adult populations, method for the measurement of melanophores density was developed. Three body areas (dorsal, lateral, ventral, all left side) each one divided in 5 sub-areas (along the anterior-posterior axis) and the tail area (5 random sub-areas) were chosen and the melanophores were counted, cell size was measured and the cell area coverage was calculated. Besides, an electron microscopy study was performed, to determine qualitative differences between the type of melanophored in the dorsal, lateral and ventral skin area of both reared and wild specimens The results showed a decrease in the number of melanophores from the dorsal (85 cells/mm2) to ventral area (15, 25 cells/mm2) in both reared and wild individuals. The melanophores of reared fish were larger than those ofwild individuals due to pigment dispersion state, and this difference was more evident in the ventral area (up to four-times). As a result, melanophore coverage in different body areas (basic cause of darkening) ranged from two-fold (dorsal area: reared 85%; wild 30%) up to 6-fold higher (ventral area: reared 20%; wild 3.5%). The type of chromatophores in the dermis of reared red porgy was limited to melanophores and iridophores while wild’ fish dermis contained melanophores, iridophores and xanthophores. To identify the regulatory mechanisms involved in the control of melanophores' motility (melanin-aggregation vs. melanin-dispersion), the in vitro effect of variouschemical factors (a- and β-adrenergic agonists and antagonists, hormones) in innervated scale melanophores of adult reared and wild red porgies was investigated. Both, αagonists (norepinephrine HCl, clonidine HCl, L-phenylephrine HCl) and β -agonists (metaproterenol hemisulfate, fenoterol HBr, terbutaline hemisulfate, isoproterenol bitartrate and salbutamol) were applied at a concentration of 10-5 M for 15 min, while βantagonists (propranolol HCl, atenolol) at concentration of 10-6 M for 15 min. The previous treatments were immediately followed by another 15 min immersion in 10-5 M norepinephrine HCl to get maximum pigment aggregation to determine the melanophore receptors. The melanophores response on acetylcholine Cl, at concentrations of 10-4 M to 10-15M, and on selected hormones was also studied. Four major hormones, two responsible for melanin-aggregation (MCH, melatonin) and two responsible for melanin- dispersion (α-MSH, ACTH) were applied in vitro for 15 min at concentrations of 10-6 M to 10-12 M. a-Agonists exerted melanin-aggregating effect on scale melanophores (max: 55% to phenylephrine), while a melanin-dispersing action (>95 %) was observed in the presence of all β-agonists, within 5 min of exposure. Both α- and β-antagonists were found to disperse melanosomes in more than 75 % of the melanophores within 5 min. The percentage of melanophore aggregation following norepinephrine HCl administration was ranged between 15% (fenoterol) and 42% (salbutamol) for "b-agonists" while between 59% (yohimbine) and 87% (atenolol) for antagonists, in 15 min.Concerning hormonal control, α-MSH and ACTH produced melanin-dispersion, while MCH and melatonin (MT) a moderate and weak melanin-aggregation, respectively. These results indicate that the adrenergic receptors that mediate melanin-aggregation response of the melanophores of red porgy (P. pagrus) are alpha in nature, while receptors which mediate melanin-dispersion response are beta-adrenergic and muscarinic in nature. The skin darkening of red porgy is also under hormonal control via activation of melanophore receptors. Finally, a preliminary study on melanophore’s ontogenesis was perfromed. The main developmental stages (prelarvae, larvae, postlarvae, juvenile (day 75)) were selected and skin melanophore’s development was monitored at macroscopically and ultrastructural level. The melanophores present on the red porgy body from embryonic and prelarvae stage were mainly in aggregated state. The complete skin darkening similar to reared adult individuals as result of melanin dispersion state was well developed on 75 day postfertilization may be due to nutritional and environmental reasons.

Tα χρωματοφόρα (μελανοφόρα, ξανθοφόρα, ερυθροφόρα, λευκοφόρα, ιριδοφόρα, κυανοφόρα) δίδουν το χρώμα στο δέρμα των ψαριών. Eμπλέκονται στους δύο τύπους αλλαγής (μορφολογική, φυσιολογική) του χρώματος. H μορφολογική αλλαγή του χρώματος σχετίζεται με τη μορφή των κυττάρων και την πυκνότητα της χρωστικής, η φυσιολογική αλλαγή του χρώματος σχετίζεται με την μετακίνηση της χρωστικής και προκαλεί την γρήγορη απόκριση των χρωματοφόρων στα ερεθίσματα. H αλλαγή του χρώματος στα ψάρια ελέγχεται από ενδογενείς (νευρικό, ορμονικό σύστημα) και εξωγενείς (περιβάλλον) παράγοντες. H προσαρμογή τους στο υπόστρωμα είναι ο κυριότερος μηχανισμός προστασίας και βασίζεται στην μετακίνηση, συγκέντρωση και διασπορά, της χρωστικής των χρωματοφόρων μέσω των μικροϊνιδίων και των μικροσωληνίσκων. Tο φαγκρί, Pagrus pagrus, συγκεντρώνει μια σειρά από πλεονεκτήματα που το καθιστούν ένα πολύ ενδιαφέρον είδος για τις υδατοκαλλιέργειες. Παρά ταύτα, η μαζική παραγωγή του παρεμποδίζεται από την αλλαγή χρώματος (μαύρο αντί ροζ) που παρουσιάζει σε συνθήκες εκτροφής. Προκειμένου να περιγραφούν οι ποσοτικές χρωματικές διαφορές μεταξύ εκτρεφόμενων και άγριων ατόμων, μελετήθηκαν άτομα τόσο από φυσικούς όσο και από εκτρεφόμενους πληθυσμούς. Η μελέτη εστιάσθηκε σε 3 περιοχές στην αριστερή πλευρά του σώματος (ράχη, μέση, κοιλιά), υποδιαιρεμένες σε 5 οριζόντιες (κεφαλο-ουραίος άξονας) υπο-περιοχές η καθεμιά καθώς και στον άνω λοβό της ουράς (5 τυχαίες υποπεριοχές), όπου μετρήθηκε ο αριθμός και το μέγεθος των μελανοφόρων κυττάρων και υπολογίστηκε η επιφάνεια κάλυψης του δέρματος. Eπιπλέον, δείγματα από τις τρεις περιοχές του σώματος (ραχιαία, πλευρική, κοιλιακή) παρατηρήθηκαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο προκειμένου να προσδιοριστούν οι ποιοτικές διαφορές μεταξύ των δύο πληθυσμών. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι ο αριθμός των κυττάρων στον ραχο-κοιλιακό άξονα μειώνεται από 85 σε 26 και από 85 σε 15 κύτταρα/mm2 στα εκτρεφόμενα και άγρια άτομα αντίστοιχα ενώ το μεγέθος των κυττάρων στο δέρμα των εκτρεφόμενων ατόμων είναι τετραπλάσιο (κοιλιά) αυτού των άγριων ατόμων. Επίσης, η καλυπτόμενη από μελανοφόρα κύτταρα επιφάνεια του δέρματος στα εκτρεφόμενα άτομα (που αποτελεί και την βασική αιτία του μαύρου χρώματος), είναι υπερδιπλάσια (ράχη, 85% έναντι 30%) έως και εξαπλάσια (κοιλιά, 20% έναντι 3.5%) έναντι αυτού των άγριων ατόμων. Tα χρωματοφόρα απαντούν μόνο στην δερμίδα των εκτρεφόμενων και άγριων ατόμων. Στα εκτρεφόμενα παρατηρήθηκαν μελανοφόρα και ιριδοφόρα ενώ στα άγρια μελανοφόρα, ιριδοφόρα και ξανθοφόρα. Σε μια προσπάθεια προσδιορισμού των ουσιών που επηρεάζουν την συγκέντρωση της μελανίνης λειτουργικών μελανοφόρων, στα λέπια ενήλικων φαγκριών, διεξήχθη φαρμακολογική έρευνα παρουσία μιας σειράς α- και β-αδρενεργικών αγωνιστών και ανταγωνιστών ουσιών καθώς και ορμονών in vitro. Ως α-αγωνιστές χρησιμοποιήθηκαν οι: νοραδρεναλίνη, κλωνιδίνη και φαινυλεφρίνη, ως β-αγωνιστές οι: μεταπροτερενόλη, φενοτερόλη, τερβουταλίνη, ισοπροτερενόλη και σαλβουταμόλη, στην συγκέντρωση των 10-5 M. Ως α-ανταγωνιστές χρησιμοποιήθηκαν οι: τολαζολίνη και υοχιμβίνη και ως β-ανταγωνιστές οι: προπρανολόλη και ατενολόλη στην συγκέντρωση των 10-6M. Tόσο οι αγωνιστές όσο και οι ανταγωνιστές επέδρασαν για 15 min. Eπιπλέον χρησιμοποιήθηκε νορεπινεφρίνη (10-5 M) για 15 min, με στόχο την επίτευξη της μέγιστης συγκέντρωσης της χρωστικής των κυττάρων ώστε να προσδιοριστεί το πρότυπο των υποδοχέων. Eπίσης, μελετήθηκε η απόκριση των μελανοφόρων παρουσία ακετυλοχολίνης στις συγκεντρώσεις από 10-4M έως 10-15M. Tέλος, τέσσερεις κύριες ορμόνες, δύο που προκαλούν συγκέντρωση της μελανίνης (MCH, μελατονίνη) και δύο που προκαλούν διασπορά (α-MSH, ACTH) επέδρασαν για 15 min in vitro σε συγκεντρώσεις 10-6M έως 10-12M. Tα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αφορούν στο μέσο εκατοστιαίο ποσοστό απόκρισης έξι ραχιαίων λειτουργικών λεπιών (πάνω από την πλευρική γραμμή) δύο ενήλικων εκτρεφόμενων φαγκριών (250 g). Tα ψάρια που χρησιμοποιήθηκαν για τα διαφορετικά πειράματα εκτράφηκαν υπό όμοιες συνθήκες (δεξαμενές μαύρου χρώματος, πλήρες φάσμα ημι- φυσικού φωτός, τροφή ίδια με αυτή που χρησιμοποιείται για την εκτροφή της τσιπούρας, ανοικτό σύστημα κυκλοφορίας u964 του νερού, ιχθυοφόρτιση 10 Kg/m3). Συγκέντρωση της χρωστικής των μελανοφόρων των λεπιών παρατηρήθηκε κατά την παρουσία των α-αγωνιστών (μέγιστο: 55%, φαινυλεφρίνη) ενώ διασπορά της χρωστικής (πάνω από 95%) παρατηρήθηκε υπό την επίδραση του συνόλου των β-αγωνιστών, σε 5 min. Eπίσης, παρατηρήθηκε ότι τόσο οι α- όσο και οι β-ανταγωνιστές προκαλούν διασπορά των μελανοσωμάτων σε ποσοστό πάνω από 75% των κυττάρων σε 5 min. Tο ποσοστό (%) των μελανοφόρων που συγκεντρώθηκαν παρουσία νοραδρεναλίνης κυμάνθηκε μεταξύ 15% (φενοτερόλη) και 42% (σαλβουταμόλη) για τους "β-αγωνιστές" και μεταξύ 59% (υοχιμβίνη) και 87% (ατενολόλη) για τους ανταγωνιστές, σε 15 min. Σε ότι αφορά τον έλεγχο των ορμονών, η α-MSH και η ACTH προκαλεί διασπορά της χρωστικής ενώ η MCH και η μελατονίνη, προκαλεί μια μέτρια και μια πολύ μικρή αντίστοιχα συγκέντρωση της χρωστικής. Aπό τα αποτελέσματα προκύπτει ότι, στο φαγκρί (P. pagrus), οι αδρενεργικοί υποδοχείς οι οποίοι προκαλούν συγκέντρωση της μελανίνης των κυττάρων είναι τύπου άλφα ενώ αυτοί που προκαλούν διασπορά της μελανίνης είναι αδρενεργικοί υποδοχείς τύπου-β και μουσκαρινικοί. H σκούρυνση του δέρματος του φαγκριού ελέγχεται ορμονικά μέσω των υποδοχέων των μελανοφόρων. H μελέτη της οντογένεσης των μελανοφόρων στο σώμα των ψαριών στα κυριότερα αναπτυξιακά στάδια (προνυμφικό, νυμφικό, μετανυμφικό, ιχθυδίου 75 ημερών) μκροσκοπικά και σε επίπεδο λεπτής δομής έδειξε ότι τα μελανοφόρα με συγκεντρωμένη την χρωστική παρατηρούνται από το εμβρυακό και προνυμφικό στάδιο. Σκούρυνση του δέρματος, ως αποτέλεσμα της διασποράς της χρωστικής, ίδια με αυτή που παρατηρείται στα ενήλικα εκτρεφόμενα άτομα είναι εμφανής από την ηλικία των 75 ημερών, γεγονός το οποίο είναι, προς το παρόν άγνωστο, αν επηρεάζεται μόνο από διατροφικούς ή μόνο από περιβαλλοντικούς παράγοντες ή από συνδυασμό και των δύο. Περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για την ορθολογική λήψη μέτρων που θα βοηθούσαν στην αντιμετώπιση του προβλήματος.