Μελέτη της παθογένειας της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης: το μονοπάτι της αγγειογένεσης και ο ρόλος της λεπτίνης

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic, progressive fibrotic lung disease which is associated with lack of effective treatment and thus, poor survival. Despite extensive research, IPF pathogenesis remains unknown. Multiple mechanisms have been proposed to play a role in IPF pathogenesis, including abnormal vascular repair and remodeling, and inflammation. Indeed, there is a body of evidence suggesting that in IPF, the impairment of repair reendothelization mechanisms following alveolar injury may lead to destruction in lung architecture and fibrosis. Notably, failure of reendothelization may induce loss of the alveolar-capillary barrier integrity which might be considered as the point after which fibrosis may be inevitable. On the other hand, studies have suggested that inflammation may play a role in the development of IPF. Histology demonstrates the presence of inflammatory cells close to areas of dense fibrosis. Recent findings suggest that chronic inflammation resulting from repetitive microinjury may participate in the initiation of the fibrotic process. Endothelial progenitor cells (EPCs) represent a subset of bone marrow-derived stem cells which may be essential in parenchymal repair and reconstitution of the damaged vascular bed. Two subtypes of EPCs exist. Late EPCs may differentiate into mature endothelial cells and repair injured blood vessels while “early EPCs” (i.e. EPCs that grow into colony forming units (CFU) on fibronectin following 5-7 days culture) secrete angiogenic cytokines such as VEGF and enhance the angiogenic process. The important role of EPCs in lung repair has been suggested from previous studies in animal models and humans. Notably, reduced EPCs numbers have been associated with persistent fibrotic changes, not due to IPF, in humans following lung injury. In this respect, one might argue that EPCs might also play a pivotal role in IPF. However, data in IPF patients are sparse to few reports. Leptin is a protein that is mainly produced by adipose tissue, however it is secreted in lower amounts by various other tissues. Recent investigations have identified the lung as a leptin responsive and producing organ, while extensive research has been published concerning leptins role in the respiratory system. Beyond its role in the regulation of food intake and body composition, leptin exerts pro-inflammatory properties. According to experimental data, increased leptin levels enhance liver inflammation and fibrogenesis. In fact, leptin is essential for the induction of transforming growth factor-β (TGF-β) in the context of chronic liver injury that ultimately leads to liver fibrosis. In this respect, one could argue that leptin may enhance lung fibrogenesis. However literature lacks data concerning leptins role in pulmonary fibrosis. Adiponectin, that is the most abundant gene product of adipose tissue, demonstrates anti-inflammatory properties. Several studies have shown that adiponectin antagonizes leptins profibrotic properties. Adiponectin inhibits the TGF-β induced expression of profibrogenic cytokines (e.g. CTGF) while adiponectin knock-out mice exhibit induced renal interstitial fibrosis that is ameliorated by adiponectin replacement. The latter observations mirror the hypothesis that adiponectin may have a protective effect in lung fibrosis, however there are no reports in the literature examining this effect. In this respect, we aimed to investigate the role of angiogenesis and inflammation in the development of IPF. For the analysis of the role of angiogenesis we assessed the levels of EPCs in IPF patients and controls. Furthermore, we sought to investigate soluble VEGF serum levels and mRNA VEGF expression of EPCs in order to provide further insight in the proangiogenic activity and mobilization of EPCs from the bone marrow. We included 23 IPF patients and 15 healthy volunteers in the study. All patients underwent clinical examination, pulmonary function tests, and arterial blood gas (ABGs) analysis and echocardiography. IPF patients exhibited statistically significantly decreased number of early EPCs CFU per well when compared to controls. The number of colonies per well correlated negatively statistically significantly with P(A-a)O2 in IPF patients. When we evaluated EPCs levels according to the degree of systolic pulmonary arterial pressure (sPAP) we found that IPF patients with sPAP≥35mmHg had statistically significant reduced number of early EPCs colonies when compared with patients with sPAP<35mmHg. Quantification of mRNA levels by real-time PCR showed that IPF patients present statistically significant increased relative VEGF expression when compared with controls. In order to examine the role of inflammation in IPF we assessed the concentrations of leptin and adiponectin in serum, and the levels of leptin in exhaled breath condensate (EBC) and bronchoalveolar lavage fluid (BAL) of IPF patients and controls and we sought to investigate their association with clinical indices of disease severity. The study population consisted of 37 IPF patients and 22 healthy volunteers. Serum leptin presented no significant differences in male and female patients when compared to healthy volunteers of the same gender. Serum adiponectin levels did not differ significantly between patients and controls. Leptin/adiponectin ratio in male patients was positively associated with PaO2. Leptin levels when adjusted for BMI in male patients with PaO2<65 were significantly reduced as compared to male patients with PaO2≥65mmHg. Additionally, leptin/adiponectin ratio in male IPF patients with PaO2<65 mmHg was significantly reduced vs male patients with PaO2≥65 mmHg. Furthermore, leptin/adiponectin ratio in male subjects was negatively correlated with 6-minute walking distance. Finally, EBC and BAL leptin levels were not significantly correlated with the corresponding serum leptin levels. We conclude that early EPCs levels are reduced in IPF patients compared to controls and that EPCs derived from IPF patients, exhibit increased endogenous VEGF production. Notably, early EPCs levels were significantly lower in patients with increased pressure in the pulmonary circulation. In this respect, the findings of the present study underline potentially significant implications of early EPCs in IPF and might provide further insight in the understanding of the pathogenesis of the disease. Additionally, the present study provides evidence suggesting a possible role of leptin in the severity and/or pathogenesis of IPF. Notably, leptin and leptin/adiponectin ratio were significantly reduced in male IPF patients with hypoxia. Additionally, we did not observe any significant correlation of leptin EBC and BAL levels with serum leptin concentrations suggesting that leptin may be locally produced within the lung. However, the mechanisms and physiological relevance of the aforementioned findings deserve further investigation.

Η Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση (ΙΠΙ, Idiopathic Pulmonary Fibrosis) είναι μια χρόνια νόσος η οποία οδηγεί σε καταστροφή της αρχιτεκτονικής του πνευμονικού παρεγχύματος. Σύμφωνα με τις διεθνείς θέσεις ομοφωνίας, η ΙΠΙ ορίζεται σαν μια ειδική μορφή χρόνιας και προοδευτικά επιδεινούμενης ινοποιού διάμεσης πνευμονίας με άγνωστη αιτιολογία. Σε μια προσπάθεια εύρεσης αποτελεσματικής θεραπείας, πολλές έρευνες τα τελευταία χρόνια έχουν επικεντρωθεί στη μελέτη της παθογένειας της ΙΠΙ, ωστόσο ως σήμερα η παθογένεια της νόσου παραμένει άγνωστη. Μια από τις πιο πρόσφατες υποθέσεις υποστηρίζει ότι κάποιο άγνωστο ως σήμερα ερέθισμα κινητοποιεί διάφορους μηχανισμούς που δρουν παράλληλα με τελικό αποτέλεσμα την εναπόθεση κολλαγόνου στο πνευμονικό παρέγχυμα και την καταστροφή της αρχιτεκτονικής του. Δύο από αυτούς τους μηχανισμούς είναι η αγγειογένεση και η φλεγμονή. Τα κυκλοφορούντα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα (circulating endothelial progenitor cells, EPCs) αποτελούν μια ομάδα κυττάρων του μυελού των οστών που είναι απαραίτητα για την επιδιόρθωση των βλαβών του αγγειακού δικτύου κατά την ενήλικη ζωή. Τα κύτταρα αυτά έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται προς ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα και να εκκρίνουν παράγοντες που επάγουν την αγγειογένεση.Η λεπτίνη είναι μια πρωτεΐνη που παράγεται κυρίως από τα λιποκύτταρα σε ποσά ανάλογα του συνολικού ποσοστού λίπους του οργανισμού. Η λεπτίνη παράγεται, σε μικρότερη όμως έκταση, και από άλλα όργανα και ιστούς όπως ο πνεύμονας. Η λεπτίνη είναι σημαντικός μεσολαβητής της ανοσολογικής απάντησης και έχει προφλεγμονώδη δράση. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η λεπτίνη έχει σημαντική προϊνωτική δράση στο ήπαρ καθώς είναι απαραίτητη για την επαγωγή του transforming growth factor-β. Η αδιπονεκτίνη που παράγεται και εκείνη από το λιπώδη ιστό έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες και ανταγωνίζεται την προϊνωτική δράση της λεπτίνης. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα αποφασίσαμε να μελετήσουμε το ρόλο της αγγειογένεσης και της φλεγμονής στην παθογένεια της ΙΠΙ. Για την ανάλυση της συμμετοχής της αγγειογένεσης στην ΙΠΙ μετρήσαμε τα επίπεδα EPCs σε ασθενείς με ΙΠΙ και υγιείς εθελοντές. Επιπλέον, μετρήσαμε τα επίπεδα του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (vascular endothelial growth factor, VEGF) στον ορό προκειμένου να αξιολογήσουμε διαταραχές στο μηχανισμό κινητοποίησης των EPCs από το μυελό των οστών. Τέλος θελήσαμε να μελετήσουμε τη δράση των EPCs και έτσι εξετάσαμε την ενδογενή παραγωγή VEGF από τα EPCs σε ασθενείς και μάρτυρες. Στη μελέτη συμμετείχαν 23 ασθενείς με ΙΠΙ και 15 υγιείς εθελοντές. Διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντικά μικρότερος αριθμός αποικιών EPCs ανά τριβλίο στην ομάδα των ασθενών συγκριτικά με τους μάρτυρες. O αριθμός των αποικιών στην ομάδα των ασθενών παρουσίαζε στατιστικά αρνητική σημαντική συσχέτιση με τη P(A-a)O2 Επίσης, παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς με πνευμονική υπέρταση (sPAP≥35mmHg) παρουσίαζαν στατιστικά σημαντικά μικρότερο αριθμό αποικιών έναντι εκείνων χωρίς πνευμονική υπέρταση. Επιπλέον, παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερα επίπεδα ενδογενούς έκφρασης του VEGF από τα EPCs στην ομάδα των ασθενών σε σχέση με τους εθελοντές. Για την ανάλυση της συμμετοχής της φλεγμονής στην παθογένεια της ΙΠΙ μετρήσαμε τα επίπεδα λεπτίνης και αδιπονεκτίνης σε ασθενείς με ΙΠΙ και διερευνήσαμε κατά πόσο τα επίπεδα αυτά σχετίζονται με τη βαρύτητα της νόσου όπως αυτή εκφράζεται από τα αέρια αίματος, το λειτουργικό έλεγχο του αναπνευστικού κ.α.. Επίσης, προσδιορίσαμε τα επίπεδα λεπτίνης στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα (exhaled breath condensate, EBC) και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (bronchoalveolar lavage, BAL) ασθενών με ΙΠΙ. Στην παρούσα μελέτη συμμετείχαν 37 ασθενείς με ΙΠΙ και 22 υγιείς εθελοντές. Τα επίπεδα της λεπτίνης δε διέφεραν στατιστικά σημαντικά στους άνδρες και στις γυναίκες ασθενείς συγκριτικά με τους μάρτυρες αντίστοιχου φύλου. Ωστόσο, ο λόγος λεπτίνης/αδιπονεκτίνης στους άνδρες ασθενείς σχετίζεται θετικά στατιστικά σημαντικά με τη PaO2. Μετά από προσαρμογή για τα σωματομετρικά χαρακτηριστικά, παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα λεπτίνης των ανδρών ασθενών με PaO2<65 ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένα συγκριτικά με τους άνδρες ασθενείς με PaO2≥65mmHg. Επιπλέον, ο λόγος λεπτίνης/αδιπονεκτίνης στους άνδρες ασθενείς με PaO2<65 mmHg ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένος συγκριτικά με τους άνδρες ασθενείς με PaO2≥65 mmHg. Επίσης παρατηρήσαμε ότι στην ομάδα των ανδρών ασθενών τα επίπεδα λεπτίνης παρουσιάζουν αρνητική συσχέτιση με την απόσταση που διανύθηκε κατά τη δοκιμασία βάδισης 6 λεπτών. Επιπλέον, ο λόγος λεπτίνης/αδιπονεκτίνης παρουσίαζε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση με τη συνολική βαθμολογία του ερωτηματολογίου saint George Respiratory Questionnaire που αντικατοπτρίζει χειρότερη σχετιζόμενη με την κατάσταση της υγείας ποιότητα ζωής. Τέλος, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση των επιπέδων λεπτίνης στο EBC και στο BAL με τη συγκέντρωση λεπτίνης στον ορό που λήφθηκε σύγχρονα. Συμπερασματικά, διαπιστώσαμε ότι οι ασθενείς με Ιδιοπαθή Πνευμονική Ίνωση παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα κυκλοφορούντων πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία συσχετίζονται με τη βαρύτητα της νόσου και την ανάπτυξη πνευμονικής υπέρτασης. Τα κυκλοφορούντα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα των ασθενών με ΙΠΙ παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση VEGF. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η λεπτίνη και ο λόγος λεπτίνης/αδιπονεκτίνης είναι μειωμένοι σε ασθενείς με ΙΠΙ και χαμηλή PaO2. Επίσης τα επίπεδα λεπτίνης στο EBC δε σχετίζονται στατιστικά σημαντικά με τα αντίστοιχα επίπεδα στον ορό γεγονός που υποδεικνύει ότι η λεπτίνη παράγεται στον πνεύμονα ανεξάρτητα από τη συστηματική έκκρισή της. Τέλος διαπιστώσαμε ότι ο λόγος λεπτίνης/αδιπονεκτίνης σχετίζεται με περιορισμένη ικανότητα για άσκηση (όπως αντανακλάται από τη δοκιμασία βάδισης) και χειρότερη ποιότητα ζωής. Τα ευρήματά μας χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης προκειμένου να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της αγγειογένεσης και της λεπτίνης στην παθογένεια της Ιδιοπαθούς Πνευμονικής Ίνωσης.