Παραγωγή μικροβιακών δευτερογενών μεταβολιτών και βιοτεχνολογική αξιολόγησή τους σαν φυσικά φάρμακα

Abstract

The current dissertation focuses on two strains of Basidiomycetes of great nutraceutical interest (Pleurotus ostreatus and Ganoderma australe) growing in submerged cultures, aiming at their biotechnological application in discovery of natural products. Both strains which are studied for the first time were obtained from the ATHUM Culture Collection of Fungi of the National and Kapodistrian University of Athens. The primary objective of the study was oriented to identify the most suitable culture medium for maximum biomass production for both strains. The Biolog FF MicroPlate was used to screen 95 different carbon sources for growth monitoring. Response surface methodology based on the central composite design was applied to explore the optimum concentrations of carbon and nitrogen sources of culture medium. When the improved culture medium was tested in a 20 L stirred tank bioreactor, the biomass reached its maximum value 10.1 g/L after 112 h and 39.2 g/L after 68 h of growth in the cases of G. australe and P. ostreatus, respectively. Additionally, the productivity was increased by 60% and 79% for the G. australe and P. ostreatus bioprocess, respectively. This work also demonstrates the nutraceutical composition (e.g. dietary fibers, α- and β-glucans and essential fatty acids) of biomass obtained by submerged fermentation of the studied strains in bioreactor. Indeed, in many cases, nutraceuticals were obtained in highest levels in the mycelium comparing with those of corresponding fruit bodies found in nature. Finally, this study presents the isolation and identification of compounds derived from biomass, obtained by submerged fermentation of both strains in bioreactor. For this purpose, the biomass extracted with suitable organic solvents. The chromatographic separation of extracts was mainly based on different techniques [e.g. medium pressure liquid chromatography (MPLC) and fast centrifugal partition chromatography (FCPC)]. The pure compounds were elucidated with (¹³C-NMR, ¹H-NMR, 2D NMR-spectroscopic analyses, ESI-HRMS and chemical correlations combined with GC/MS experiments. Based on existing literature data, all compounds isolated exert numerous health benefits. Specifically, the fractionation of the G. australe extract led to the isolation of 2 terpenoids and 3 fatty acids. It is reported for the first time the presence of 9-palmitoleic acid and ergosta-55,7,22-trien-3β-ol in the mycelium of G. australe, while 19-octacosenoic acid has not been isolated again from this mushroom strain. Besides, from the mycelium of P. ostreatus, 5 fatty acids and their esters, 4 phenolic metabolites, 2 nucleotides and 3 alkaloids were isolated and identified. An interesting observation was that trans 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxynapthalen-1(2H)-one, indolo-3-carboxylic acid, 3-formyl-pyrrole and 4-hydroxy-benzoic acid were isolated for the first time from P. ostreatus. To conclude, the findings of this study are regarded valuable, as the established fermentation process led to the efficient production of biomass by the studied strain containing bioactive natural products.

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν σε συνθήκες υγρής βυθισμένης καλλιέργειας δύο είδη μακρομυκήτων ιδιαίτερου φαρμακοδιατροφικού ενδιαφέροντος (Pleurotus ostreatus και Ganoderma australe) με σκοπό τη βιοτεχνολογική τους αξιοποίηση ως φυσική πηγή βιολειτουργικών διατροφικών συστατικών. Τα ελληνικά στελέχη των παραπάνω μακρομυκήτων που μελετήθηκαν για πρώτη φορά βρίσκονται κατατεθειμένα στη Συλλογή Καλλιεργειών ATHUM του Πανεπιστημίου Αθηνών. Ο αρχικός στόχος της μελέτης προσανατολίστηκε στον προσδιορισμό του καταλληλότερου μέσου ανάπτυξης για μέγιστη παραγωγής βιομάζας από τους δύο μακρομύκητες. Σε αυτήν την κατεύθυνση, με τη χρήση της μεγάλης αποδοτικότητας μεταβολικής ανάλυσης FF Biolog, πραγματοποιήθηκε αρχική χαρτογράφηση του μεταβολισμού των μακρομυκήτων για τον περαιτέρω ορθότερο σχεδιασμό του μέσου ανάπτυξης για παραγωγή βιομάζας. Η διερεύνηση της βέλτιστης σύνθεσης του μέσου ανάπτυξης για μέγιστη παραγωγή βιομάζας πραγματοποιήθηκε με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης. Μετά τη δοκιμή του άριστου μέσου ανάπτυξης σε βιοαντιδραστήρα συνεχούς ανάδευσης όγκου 20 L, η παραγωγή βιομάζας έλαβε τη μέγιστη τιμή 10.1 g/L μετά από 112 h για την περίπτωση του G. australe, και 39.2 g/L μετά από 68 h καλλιέργειας για το P. Ostreatus. Η παραγωγικότητα δε, αυξήθηκε κατά 60% και 79%, αντίστοιχα για το G. australe και το P. ostreatus. Διερευνήθηκε ακόμα η σύσταση της βιομάζας από την ανάπτυξη των δύο μακρομυκήτων στο βιοαντιδραστήρα ως προς το περιεχόμενό τους σε βιολειτουργικά συστατικά (π.χ. διαιτητικές ίνες, α- και β-γλουκάνες και διατροφικά πολύτιμα λιπαρά οξέα). Στα μυκήλια και των δύο μακρομυκήτων ανακτήθηκαν φαρμακοδιατροφικά συστατικά που σε πολλές περιπτώσεις τα ποσοστά τους βρέθηκαν υψηλότερα σε σχέση με των αντίστοιχων καρποσωμάτων στην φύση. Τέλος, με σκοπό την απομόνωση και ταυτοποίηση των μεταβολιτών που παράχτηκαν από τους δύο μακρομύκητες σε βιοαντιδραστήρα διεξάχθηκε εκχύλιση της συλλεγόμενης βιομάζας με κατάλληλους οργανικούς διαλύτες. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των εκχυλισμάτων βασίστηκε σε διάφορες τεχνικές [π.χ. υγρή χρωματογραφία μέσης πίεσης (MPLC) και χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντρηση (FCPC)]. Για την ταυτοποίηση των ουσιών που απομονώθηκαν χρησιμοποιήθηκαν φασματοσκοπικές τεχνικές (¹³C-NMR, ¹H-NMR, και 2D NMR, ESI-HRMS) και χημικές συσχετίσεις σε συνδυασμό με τις GC/MS αναλύσεις. Από βιβλιογραφικά δεδομένα, οι μεταβολίτες που απομονώθηκαν βρίσκουν ευρύ φάσμα εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων. Από το μυκήλιο του G. australe, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 2 τερπενοειδή μόρια και 3 λιπαρά οξέα. Για πρώτη φορά αναφέρεται η παρουσία του 9-παλμιτολεϊκού οξέος και της εργοστα-5,7,22-τριεν-3β-όλης στο μυκήλιο, ενώ το 19-οκτακοσενοϊκό οξύ απομονώθηκε για πρώτη φορά από το G. australe. Από το μυκήλιο του P. ostreatus, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 5 λιπαρά οξέα και οι αντίστοιχοι εστέρες τους, 4 φαινολικοί μεταβολίτες, 3 αλκαλοειδή και 2 νουκλεοτίδια. Η trans-3,4-διυδρο-3,4,8-τριυδροξυναφθαλεν-1(2Η)-όνη, το ινδολο-3-καρβοξυλικό οξύ, η 3-φορμύλ-πυρρόλη και το π-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το P. ostreatus. Συνοψίζοντας, η προτεινόμενη διεργασία ανάπτυξης του G. australe και του P. ostreatus οδήγησαν σε υψηλή παραγωγή βιομάζας πλούσια σε βιοενεργούς μεταβολίτες.