Ανάπτυξη μεθόδων για τον προσδιορισμό διαφόρων κατηγοριών αντιβιοτικών στο γάλα με τεχνικές προκατεργασίας και χρωματογραφικής ανάλυσης με χρήση υλικών και στηλών συμβατικής και νέας τεχνολογίας

Abstract

Milk is one of the globally most consumed foods of great importance for human growth. As it contains essential nutritional components such as saturated fat, protein and calcium, it is considered to be a necessary food of low cost. However, its quality can be impaired due to the prevalent use of antimicrobials as feed additives in veterinary medicine. The target of this work was to study the applicability of new columns and sample preparation materials in the analysis of milk matrix, for the determination of several antibiotic classes. In the first method, ultrasound-assisted matrix solid-phase dispersion (MSPD) was applied to isolate eight cephalosporins from milk. Multi-residue analysis was subsequently performed by HPLC-diode array detection and the use of a monolithic column. Extraction yield by matrix solid-phase dispersion using Nexus sorbent was higher than various investigated SPE protocols. In the second developed method the novel core shell analytical column, KINETEX 2.6 μm, was used for the determination of eight antimicrobial agents representing two different classes: penicillins and amphenicols. A modified matrix solid phase dispersion procedure was applied for the extraction and clean-up procedure of antibiotics from milk using a mixture of Strata by Phenomenex and QuEChERS as a sorbent. Ultrasound-assisted matrix solid phase dispersive extraction was applied for the confirmatory analysis of 12 β-lactams in milk by HPLC-DAD in the third method. Target analytes were effectively extracted using a mixed sorbent of QuEChERS technique and OASIS-HLB providing a matrix free from any endogenous interference. A sensitive and selective confirmatory method for milk residue analysis regarding ten quinolones and eight cephalosporins by LC-MS/MS has been developed in the fourth part. For the chromatographic separation of target analytes Perfectsil ODS-2 column was used. Ultrasound assisted matrix solid phase dispersion procedure was applied for the extraction and clean-up procedure of antimicrobials agents from milk matrix using as a sorbent a mixture of Bond Elut Plexa and QuEChERS. Ultrasound assisted matrix solid phase dispersion procedure was applied for the extraction and clean-up procedure of tetracyclines in the fifth method, using Plexa sorbent. The described confirmatory methods are simple validated assays, which can be readily adapted by any laboratory for the quality control and the quantitative determination of all examined antimicrobial residues in milk. Validation was performed according to the performance criteria of EU Decision 2002/657/EC. The results of validation process demonstrate that all methods are suitable for application in EU statutory veterinary drug residue surveillance programs. Observed LOQs were lower than respective MRL values and the usefulness of all methods was proved in the analysis of milk samples purchased from local market.

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη πολυ-υπολειμματικών μεθόδων HPLC για τον προσδιορισμό αντιβιοτικών σε πολύπλοκα υποστρώματα, όπως το γάλα. Η επικύρωση όλων των μεθόδων που αναπτύχθηκαν έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια της Ευρωπαϊκής Απόφασης 2002/657/ΕΕ. Στην πρώτη μέθοδο HPLC-DAD που αναπτύχθηκε, προσδιορίστηκαν 8 κεφαλοσπορίνες με τη μονολιθική στήλη Chromolith RP-18e. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία είναι η πρώτη μέθοδος που χρησιμοποιεί για τον προσδιορισμό κεφαλοσπορινών στο γάλα, τόσο μονολιθική στήλη, όσο και την τεχνική της MSPD. Στη δεύτερη ενότητα αναπτύχθηκε μέθοδος HPLC-DAD, για τον προσδιορισμό πενικιλινών και αμφενικολών με στήλη τεχνολογίας συμπαγούς πυρήνα Kinetex C18, για πρώτη φορά σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Η παραλαβή των συστατικών από το γάλα έγινε με χρήση της MSPD με προσροφητικό υλικό ένα μίγμα του υλικού πλήρωσης της μικροστήλης Strata-Χ και του υλικού QuECheRS. Αυτός ο συνδυασμός εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, δίνοντας ικανοποιητικά αποτελέσματα (88%< R <102%). Στην τρίτη μέθοδο HPLC-DAD που αναπτύχθηκε, προσδιορίστηκαν 12 β-λακτάμες στο γάλα μετά από MSPD με προσροφητικό υλικό ένα μίγμα του υλικού πλήρωσης της μικροστήλης Oasis-HLB και του υλικού QuECheRS. Αυτός ο συνδυασμός εφαρμόστηκε για πρώτη φορά σύμφωνα με τη βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό β-λακταμών στο γάλα. Η τέταρτη μέθοδος που αναπτύχθηκε, αφορά στον ταυτόχρονο προσδιορισμό 18 ενώσεων των ομάδων των κινολονών και των κεφαλοσπορινών στο γάλα σε διάταξη LC-MS/MS. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η Perfectsil ODS-2. Για την κατεργασία των δειγμάτων γάλακτος εφαρμόστηκε για πρώτη φορά η τεχνική της MSPD, με προσροφητικό υλικό ένα μίγμα του υλικού πλήρωσης της μικροστήλης Bond Elut Plexa και του υλικού QuECheRS. Στην τελευταία μέθοδο που αναπτύχθηκε, προσδιορίστηκαν υπολείμματα 5 τετρακυκλινών σε δείγματα γάλακτος με HPLC-DAD και με τη στήλη LiChroCART-LiChrospher® 100 RP-18, μετά από προκατεργασία με MSPD. Απ’ όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, προκύπτει ότι οι πολυ-υπολειμματικές μέθοδοι προσδιορισμού αντιμικροβιακών παραγόντων που αναπτύχθηκαν στο γάλα, εμφανίζουν ποικίλα πλεονεκτήματα, τα οποία συνοψίζονται ακολούθως: α) Διαχωρισμός συστατικών με χρωματογραφικές στήλες νέας τεχνολογίας (Μονολιθική-Συμπαγούς Πυρήνα). β) MSPD για την κατεργασία γάλακτος - υψηλές ανακτήσεις αντιμικροβιακών παραγόντων. γ) Χρήση καινοτόμων προσροφητικών υλικών (QuECheRS). δ) Μικρός συνολικός χρόνος ανάλυσης. ε) Ελάχιστη χρήση διαλυτών. στ) Χαμηλά όρια ανίχνευσης<MRLs. ζ) Επικύρωση μεθόδων σύμφωνα με 2002/657/ΕΕ. η) Εφαρμόσιμες σε εργαστήρια ελέγχου ποιότητας. Τα χαρακτηριστικά που συγκεντρώνουν οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν, καθιστούν την εφαρμογή τους δυνατή, αξιόπιστη και εύκολη στην ανίχνευση και στον ποσοτικό προσδιορισμό σε ότι αφορά στα προσδιοριζόμενα συστατικά σε ένα από τα πιο διαδεδομένα κτηνοτροφικά προϊόντα, το αγελαδινό γάλα.