Μελέτη βιοδραστικών ενώσεων φυσικών προϊόντων με υψηλής ευαισθησίας φασματοσκοπία NMR κρυογενικής τεχνολογίας και έλεγχος της αντινεοπλασματικής και αντιαγγειογενετικής τους δράσης

Abstract

The main objective of the current PhD thesis was the study of flavonoids with specific structural characteristics and substitutions which confer to their biological proeperties under investigation.Firstly, the structural characteristics of a group of selected flavonoids were studied by the use of 1D and 2D NMR spectroscopy. Furthermore, by the use of diffusion spectroscopy DOSY NMR a new methodology was developed for the separation and the identification of flavonoids in mixtures. Then, it was studied the mechanism of the antioxidant activity of flavonoids and their ability to chelate two essential metal ions, Zn2+ and Fe2+. NMR spectroscopic studies and DFT theoretical calculations indicate sites 3-4 and 4-5 as coordination sites of Zn2+ through the deprotonation of OH-3 and OH-5 for quercetin and luteolin, respectively. Also, it was observed that the complexation of quercetin with Zn2+ facilitates chelation with Fe2+ due to OH-3 deprotonation. This conclusion can effectively justify the improved antioxidant activities of flavonoids in in vitro studies when they are already complexed to metal ions. Moreover, we studied their antiproliferative activity against two human cancer cell lines and their structure-activity relationship. The presence of a strong intermolecular hydrogen bond in combination with two methoxy groups in positions 3 and 4’ as well as hydroxyl groups in positions 5, 7 and 3’ were found to be essential structural parameters for a potent antiproliferative activity.5,7,3’-trihydroxy-3,4’-dimethoxyflavone, which demonstrated the strongest anticancer activity, was selected in order to study its antiangiogenic activity. This flavonoid was able to inhibit VEGF-induced angiogenesis in HUVECs endothelial cells with a very low IC50 value. Thus, dimethoxyflavone should be promoted for further anticancer and antiagiogenic evaluation studies and can be a lead compound for the synthesis of more potent compounds.The flavonoid quercetin was selected in order to study its ability to induce apoptosis in T-leukemic cells. By the use of a multidisciplinary approach, in vitro experiments, biochemical and biophysical studies as well as docking calculations, it was suggested that quercetin induces apoptosis by directly binding the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL in BH3 domain. A state-of-the-art technique was used in order to study the interaction of water-soluble quercetin derivatives with Bcl-2 protein. In-cell NMR spectroscopy indicated that this analogue interacts directly with Bcl-2 in intact Jurkat leukemic cancer cells that overexpress Bcl-2. This is the first report of the interaction of a mitochondrial membrane protein with a small molecule at a cellular level. Thus, in-cell NMR spectroscopy is a highthrouput and robust technique for the screening of drug-protein receptors interactions with promishing future applications.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η μελέτη πρότυπων φλαβονοειδών που φέρουν συγκεκριμένα δομικά χαρακτηριστικά και υποκαταστάσεις ώστε να διαθέτουν βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Αρχικά, μελετήθηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά και οι φυσικοχημικές ιδιότητες επιλεγμένων φλαβονοειδών με χρήση φασματοσκοπίας NMR 1D και 2D. Στη συνέχεια με χρήση φασματοσκοπίας διάχυσης DOSY NMR αναπτύχθηκε μια νέα μεθοδολογία για τον ποιοτικό διαχωρισμό και την ταυτοποίηση φλαβονοειδών σε μίγματα. Έπειτα, μελετήθηκε ο μηχανισμός της αντιοξειδωτικής δραστικότητας των φλαβονοειδών και η ικανότητά τους να συμπλοκοποιούνται με δύο σημαντικά μεταλλικά ιόντα, τον Zn2+ και τον Fe2+. Μελέτες φασματοσκοπίας 1D NMR και θεωρητικοί υπολογισμοί σε επίπεδο DFT υπέδειξαν ως θέσεις συμπλοκοποίησης του Zn2+ τις 3-4 και 4-5 για την κερσετίνη και την λουτεολίνη, αντίστοιχα, με αποπρωτονίωση των ΟΗ-3 για την πρώτη περίπτωση και του ΟΗ-5 για την δεύτερη. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι η συμπλοκοποίηση της κερσετίνης με Zn2+ υποβοηθά τη σύμπλεξη με τον Fe2+ λόγω αποπρωτονίωσης. Η διαπίστωση αυτή μπορεί να αποτελέσει μια ικανή επεξήγηση του φαινομένου της βελτιωμένης αντιοξειδωτικής ικανότητας των φλαβονοειδών όταν είναι ήδη σε συμπλοκοποιημένη μορφή που έχει παρατηρηθεί σε προηγούμενες in vitro μελέτες.Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η μελέτη της αντιπολλαπλασιαστικής τους δράσης ενάντια σε δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές και η συσχέτιση των δομικών χαρακτηριστικών με τη δραστικότητα. Διαπιστώθηκε ότι τα φλαβονοειδή με τον ισχυρότερο ενδομοριακό δεσμό έχουν βελτιωμένη δραστικότητα, ενώ η παρουσία μεθόξυ υποκαταστατών στις θέσεις 3 και 4’ και υδροξυλομάδων στις 5,7 και 3’ είναι απαραίτητη για ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική δράση.Για την αντιαγγειογενετική δραστικότητα επιλέχθηκε να μελετηθεί το φλαβονοειδές 5,7,3’-τριυδροξυ-3,4’-διμεθοξυφλαβόνη, το οποίο παρουσίασε και τη σημαντικότερη αντικαρκινική δράση in vitro. Από τη μελέτη αυτή προέκυψε ότι το φλαβονοειδές αυτό αναστέλλει την επαγώμενη από τον VEGF αγγειογένεση στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs και αποτελεί ένα προτεινόμενο μηχανισμό. Η διμεθοξυφλαβόνη, συνεπώς, μπορεί να αποτελέσει ένωση «οδηγό» και να προωθηθεί για μελλοντικές μελέτες αντικαρκινικών και αντιαγγειογενετικών ιδιοτήτων τόσο της ίδιας όσο και πιο δραστικών αναλόγων της. Το φλαβονοειδές κερσετίνη επιλέχθηκε για την μελέτη της ικανότητάς του να επιφέρει απόπτωση σε Τ λευχαιμικά κύτταρα. Mε τη χρήση in vitro πειραμάτων αλλά και βιοχημικών και φυσικοχημικών μελετών και υπολογισμών πρόσδεσης, διαπιστώθηκε ότι η κερσετίνη αλληλεπιδρά άμεσα με τις αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες Bcl-2 και Bcl-xL στον τομέα ΒΗ3 επάγωντας απόπτωση. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας in-cell NMR επιτεύχθηκε η μελέτη της αλληλεπίδρασης ενός συνθετικού υδατοδιαλυτού αναλόγου της κερσετίνης με την Bcl-2 πρωτεΐνη μέσα σε ζωντανά κύτταρα Jurkat που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη αυτή. Η μελέτη αλληλεπίδρασης της Bcl-2 με μικρά μόρια αποτελεί την πρώτη σε διεθνές επίπεδο μελέτη μιτοχονδριακής μεμβρανικής πρωτεΐνης σε κυτταρικό επίπεδο. Συνεπώς, η φασματοσκοπία in-cell NMR αποτελεί ένα δυναμικό εργαλείο σάρωσης αλληλεπιδράσεων φαρμάκων και πρωτεϊνικών στόχων με δυνατότητα εξέλιξης και ιδιαίτερα υποσχόμενες μελλοντικές εφαρμογές.