Μελέτη του γονιδίου Sin1 στους μηχανισμού επιβίωσης και πολλαπλασιασμού Hodgkin και μη Hodgkin λεμφωμάτων του ανθρώπου

Abstract

Background: The novel mammalian stress activated protein kinase (SAPK) interacting protein 1 (Sin1) gene give rise to multiple isoforms through alternative splicing. Recent studies provide evidence that Sin1 is a key component of the mammalian target of rapamycin (mTOR)-Rictor complex (mTORC2), thus critically regulating the Ser473 and Thr450-phosphorylation / activation of Akt kinase that results in tumor cell survival through multiple downstream targets. Moreover, in the absence of Sin1 gene, mTOR-Raptor (mTORC1) activity is upregulated upon stimulation of the PI3K/AKT/mTOR pathway. Previous studies have shown that the AKT/mTOR oncogenic pathway is activated in many cancers including aggressive non-Hodgkin lymphomas (NHL). However, the potential role of Sin1 protein in the pathogenesis of B-cell NHL is yet unknown.Methods: The expression of Sin1 gene products was assessed by Western Blot analysis in 26 NHL and HL cell lines and 27 fresh-frozen specimens of NHL of various histologic types. In addition, expression and subcellular localization of Sin1 protein was evaluated using immunohistochemical methods, three tissue microarrays (TMA) of duplicate tumor cores from 81 specimens and 37 samples of paraffin embedded tissues, obtained prior to treatment, which included Reactive Lymph nodes (RL), Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Lymphoma (CLL/SLL), Peripheral T cell Lymphoma Non Otherwise Specified (PTLNOS), Mantle Cell Lymphoma (MCL), Follicular Lymphoma (FL), Marginal Zone Lymphoma (MZL), Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL), Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL), Burkitt Lymphoma (BL) and Multiple Myeloma (MM).Results: Sin1 isoforms 80, 76, 55 and 52 kDa were differentially expressed in immunoblots of B and T-cell NHL tested. Sin1 protein levels and activation status of its downstream target Akt, were correlated with the histological grade. This association was also seen in primary NHL tumor specimens analyzed by Western blot. Immunohistochemical analysis of Sin1 protein revealed that Sin1 was localized in the cytoplasm of tumor cells in low grade NHL, MCL and MM and in the nucleus in high grade NHL (p<0.001, chi-square test). In addition strong nuclear expression of mSin1 in high grade B-NHL and cytoplasmic in low grade B-NHL (p<0.001, chi-square test) was observed. Transfection of MSCV-Sin1.1 and MSCV-Sin1.5 plasmids to SP53 cells resulted in increased cell viability and cell growth, which was associated with decreased apoptosis. These biologic effects were associated with upregulation of Bcl-2 and Bcl-XL as well as c-FLIP suggesting downregulation of both mitochondrial and extrinsic apoptotic pathways, respectively. Conclusions: Sin1, a critical regulator of mTORC2 integrity and activity, is differentially expressed among B-NHL. Sin1 expression seems to confer AKT-dependent anti-apoptotic signals in MCL cells and possibly in other in vitro systems of B-NHL.

Εισαγωγή: Το γονίδιο που κωδικοποιεί τη πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με τις επαγόμενες από το στρες πρωτεϊνικές κινάσες mSin1 (Stress activated protein kinase INteracting protein 1 Sin1) με εναλλακτική συρραφή σχηματίζει πέντε διαφορετικές ισομορφές. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι η mSin1 αποτελεί βασικό συστατικό του συμπλόκου 2 της κινάσης στόχου της ραπαμυκίνης (Target Of Rapamycin TOR) των θηλαστικών (mTORC2) και ρυθμίζει την ενεργοποίηση της Akt, με φωσφορυλίωση στην Ser473 και την Thr450, που επάγει την επιβίωση μέσω πολλαπλών καθοδικών στόχων. Απουσία της mSin1 η ενεργότητα του συμπλόκου mTORC1 αυξάνεται επαγόμενη από την σηματοδοτική οδό PI3K/Akt/mTOR. Έχει δειχτεί ότι η ογκογόνος οδός Akt/mTOR είναι ενεργοποιημένη σε πολλούς τύπους καρκίνου και σε επιθετικά μη- Hodgkin λεμφώματα (NHL). Ωστόσο ο ρόλος της mSin1 στην παθογένεια των Β μη- Hodgkin λεμφωμάτων δεν είναι γνωστός.Μέθοδοι: Η έκφραση της mSin1 μελετήθηκε με Western Blot σε 26 NHL και HL κυτταρικές σειρές και πρωτογενή κύτταρα και 27 φρέσκους ιστούς NHL διαφόρων ιστολογικών τύπων. Επίσης η έκφραση και ο υποκυτταρικός εντοπισμός της mSin1 αξιολογήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε ιστούς εγκλεισμένους σε παραφίνη πριν την χορήγηση θεραπείας σε 118 ασθενείς με αντιδραστική λεμφαδενίτιδα, λέμφωμα από μικρά κύτταρα/χρόνια λεμφογενής λευχαιμία, λέμφωμα του μανδύα, οζώδες λέμφωμα, ,λέμφωμα οριακής ζώνης, διάχυτο λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα, αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα, λέμφωμα Burkitt, πολλαπλό μυέλωμα, περιφερικό Τ λέμφωμα μη-προσδιοριζόμενο. Αποτελέσματα: Οι ισομορφές με μέγεθος 80, 76, 55 και 52 kDa παρουσίασαν διαφορική έκφραση στα NHL που εξετάστηκαν. Τα επίπεδα της Sin1 και η ενεργοποίηση της Akt, συσχετίζονταν με τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας. Η συσχέτιση αυτή παρατηρήθηκε και σε πρωτοπαθή NHL δείγματα που μελετήθηκαν με Western blot. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση αποκάλυψε στατιστικά σημαντική διαφορά στον υποκυτταρικό εντοπισμό της Sin1 στα υψηλής και χαμηλής κακοήθειας Β λεμφώματα, το ΜΜ και το MCL (p<0.001, chi-square test). Στατιστικά σημαντική ήταν και η έντόπιση της Sin1 ανάμεσα στα υψηλής και χαμηλής κακοηθείας Β λεμφώματα (p<0.001, chi-square test). Παροδική διαμόλυνση κυττάρων SP53 με πλασμίδια MSCV-Sin1.1 και MSCV-Sin1.5 επέφερε αύξηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων και της επιβίωσης, σε συνάρτηση με μείωση της απόπτωσης. Αυτό το βιολογικό αποτέλεσμα συσχετιζόταν με μείωση των of Bcl-2 και Bcl-XL, καθώς και του c-FLIP, υποδεικνύοντας αρνητική ρύθμιση της ενδογενούς και εξωγενούς αποπτωτικού μηχανισμού. Συμπεράσματα: Η Sin1 αποτελεί κρίσιμο ρυθμιστή της συγκρότησης και ενεργότητας του συμπλόκου mTORC2, διαφορικά εκφραζόμενη στα B-NHL. Η έκφραση της Sin1 συμβάλλει στους εξαρτώμενους από την Akt αντιπαποπτωτικούς μηχανισμούς στο MCL και πιθανόν και σε άλλα in vitro συστήματα B-NHL.