Μοριακή σταδιοποίηση στον καρκίνο της κύστης

Abstract

Bladder Cancer (BC) is a lethal disease with many social and financial consequencesin our time. Despite the modern diagnostic tecniques and therapeutic approaches, theoverall mortality and morbidity is quite high. Early diagnosis, accurate staging, andoptimal treatment strategy are prerequisites for good prognosis of the disease. Themain staging and prognostic criteria of bladder cancer are derived from clinical data,histology and radiology that often lead to poor diagnosis and high incidence ofundestaging the disease in many patients. Recently there has been a lot of research inan effort to determine and detect specific molecular markers in blood, that can beused for early diagnosis of the disease, identify the effectiveness of treatment, andfollow up of patients after treatment with curative intent for identification of earlyreccurence. Under this spectrum the detection of circulating bladder cancer cells(CBC) in blood and urine, is a potential marker of reccurence, subclinical residualdisease that can lead to metastasis and cannot be detected with conventional methods.The aim of this study is:Confirmation of simultaneous mRNA detection of multiple molecular cancer markersusing RT-Multiplex PCR, in blood and urine specimens, and their combination forthe detection of circulating bladder cancer cells (CBC).The creation of a non invasive feasible technique in everyday clinical practice that candetermine fast and accurately those patients that has been understaged usingconventional methods.In the current study we examined a group of special markers for bladder cancer in aneffort to detect mRNA in blood and urine samples of patients with bladder cancer. Wehave chosen as markers the cytokeratines CK19, CK20, the epidermal growth factorreceptor (EGFR), Mucin 7 in the blood samples of patients and cytokeratine CK20,HTERT, Survivin in urine samples of patients and GAPDH as internal control of theexperiment. A protocol has been set up to find the efficiency of our technique byspiking, in tissue with known bladder cancer and healthy controls. Then MultiplexPCR protocol has been developed and we achieved detection of the markers used in30 patients with bladder cancer of different stage with no detection of the markers inthe 30 healthy controls.In conclusion, we can detect the circulating bladder cancer cells with the markersstudied in blood and urine of patients with bladder cancer without detection of them inhealthy controls. It seems that there is correlation between the number of the markersdetected and the stage of the disease and also the detection of these markers mayaffect the mortality of the disease. The sensitivity of the method can be increased iffor a test to be considered positive only detection of one marker will suffice and thespecificity of the method can increase if for a test to be considered positive all themarkers that are being tested must be detected. Overall, we have set up a noninterventional, low cost, easy and reliable protocol that could help the clinician tospecify more accurately the stage of the disease and the prognosis of each patient.

Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης αποτελεί μια επικύνδυνη νόσο με σημαντικέςκοινωνικοοικονομικές επιπτώσεις στην εποχή μας. Παρά τις σύγχρονες διαγνωστικέςαλλά και θεραπευτικές προσεγγίσεις που εφαρμόζονται, τα ποσοστά θνησιμότηταςαλλά και νοσηρότητας είναι πολύ υψηλά. Η έγκαιρη διάγνωση, η ακριβήςσταδιοποίηση και η κατάλληλη αντιμετώπιση, αποτελούν τις προϋποθέσεις για καλήπρόγνωση της νόσου. Όσον αφορά τα κύρια κριτήρια πρόγνωσης και σταδιοποίησηςτου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, αυτά προέρχονται από ιστοπαθολογικάδεδομένα, την κλινική εικόνα του ασθενούς και απεικονιστικά κριτήρια, δεδομέναπεριορισμένης αξίας που συχνά οδηγούν σε λανθασμένη διάγνωση και υψηλόποσοστό υποσταδιοποιημένων ασθενών. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνειπροσπάθειες να καθορισθούν μοριακοί (καρκινικοί) δείκτες, η ανίχνευση των οποίωνστο αίμα θα μπορούσε να συμβάλλει στην πρώιμη διάγνωση της νόσου, στηναξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπευτικής αγωγής και στηνπαρακολούθηση των ασθενών μετά τη θεραπεία τους για την έγκαιρη διάγνωση τυχόνυποτροπής. Υπό αυτό το πρίσμα, η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικώνκυττάρων στο αίμα και στα ούρα είναι ένας υποψήφιος μάρτυρας υποτροπής,υποκλινικής-υπολειπόμενης νόσου, που δύναται να οδηγήσει σε μεταστάσεις και δενανιχνεύεται μέχρι σήμερα με τις συμβατικές μεθόδους. Η μελέτη αυτή έχει σανσκοπό: Την επιβεβαίωση της έκφρασης ταυτόχρονα του mRNA πολλαπλών μοριακώνκαρκινικών δεικτών με χρήση της μεθόδου RT-Multiplex PCR, και τοσυνδυασμό αυτών σε αίμα και ούρα ασθενών, για την ανίχνευση τωνκυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ). Την δημιουργία μελλοντικά μιας τεχνικής εφικτής, μη επεμβατικής στηνκαθημερινή κλινική χρήση και η οποία θα μπορεί σύντομα και με ακρίβεια νακαθορίσει την ύπαρξη ασθενών που υποσταδιοποιήθηκαν με τη χρήση τωνέως τώρα συμβατικών τεχνικώνΣτην εργασία που παρουσιάζουμε, μελετήθηκε μια ομάδα εξειδικευμένων δεικτώνγια τον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως, με σκοπό την ανίχνευσή τους σεμεταγραφικό επίπεδο (RNA), σε αίμα και ούρα ασθενών, με καρκίνο της ουροδόχουκύστεως. Επιλέχθηκαν οι κυτοκερατίνες CK19, CK20, ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα EGFR, η Mucin 7 για τη μελέτη στα δείγματα αίματοςασθενών, καθώς και η κυτοκερατίνη CK20, η τελομεράση (HTERT), και η survivinγια τη μελέτη σε δείγματα ούρων ασθενών, ενώ ως εσωτερικός μάρτυρας τουπειράματος χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφωρικήδεϋδρογονάση GAPDH. Αρχικά αναπτύξαμε τη Multiplex PCR σε ιστό μεεπιβεβαιωμένη κακοήθεια και δείγματα αίματος και ούρων φυσιολογικών ατόμων γιατην εύρεση της ευαισθησίας της μεθόδου και ακολούθησε η εφαρμογή του στημένουπρωτοκόλλου σε 30 ασθενείς με διάφορα στάδια νόσου και σε 30 δείγματαφυσιολογικών ατόμων που χρησιμοποιήσαμε για αρνητικούς μάρτυρες.Η ιδιαίτερη αξία της Multiplex PCR έγκειται στην ανίχνευση των δεικτώνανάλογα με το στάδιο και κυρίως στην επίπτωση της ανίχνευσης με την επιβίωση τωνασθενών. Στα αποτελέσματα μας αποδεικνύουμε οτι η μέθοδος μπορεί να ανιχνεύσειτους δείκτες που μελετήθηκαν σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και στοαίμα και στα ούρα των ασθενών αυτών. Οι δείκτες αυτοί δεν ανιχνεύονται σεδείγματα φυσιολογικών ατόμων. Η ευαισθησία της μεθόδου μπορεί να αυξηθεί αν γιανα θεωρηθεί ένα δείγμα θετικό αρκεί η έκφραση έστω και ενός δείκτη ενώ ηειδικότητα αυξάνει όταν για να θεωρηθεί θετικό ένα δείγμα θα πρέπει ναανιχνεύονται όλοι οι δείκτες που μελετήθηκαν. Με αυτά τα αποτελέσματααποδεικνύουμε ότι έχουμε στήσει μια μη επεμβατική, φθηνή, αξιόπιστη, γρήγορη,εύκολη και απλή διαδικασία που μπορεί να μας βοηθήσει να προσδιορίσουμεακριβέστερα το στάδιο και την πρόγνωση του ασθενούς.