Μοριακοί μηχανισμοί που ενέχονται στην παθογένεια του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα με έμφαση στο ρόλο των ρυθμιστών των microRNAs, Drosha, Dicer και AGO2

Abstract

Lung cancer is the leading cause of cancer related death worldwide. Decades ofresearch have contributed to our understanding that lung cancer is a multistep processinvolving genetic and epigenetic alterations. Oncogene activation occurs in all lungcancers, resulting in persistent upregulation of mitogenic signals. In lung cancercommonly activated oncogenes are EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1,CDK4, EML4-ALK fusion, and BCL2. Loss of tumor suppressor gene (TSG)function is also important in lung carcinogenesis and usually results from silencing ofboth alleles. Commonly unactivated TSGs in lung cancer are TP53, RB1, STK11,CDKN2A, FHIT and PTEN. Epigenetic alterations include DNA methylation, histonemodification and microRNA regulation of gene expression. MicroRNAs are smallnon-protein encoding RNAs, responsible for the negative post transcriptionalregulation of gene expression. Studies have shown the role of microRNAs in normalpulmonary development and homeostasis but also in the pathogenesis of multiple lungdiseases including lung cancer. The biogenesis of mature and functional microRNAsrequires the orchestrated action of a group of proteins, collectively refered to asmiRNA machinery. The miRNA machinery regulates the expression of many TSGsand oncogenes in a miRNA guided fashion. Drosha, Dicer and AGO2 are maincomponents of the miRNA machinery. Our study adressed the cellular localizationand protein levels of Drosha, Dicer and AGO2, components of the miRNAmachinery, in NSCLC cell lines, and in NSCLC FFPE tissue sections. We employedimmunofluorescence and Western blot analysis in five NSCLC cell lines andimmunohistochemistry on FFPE NSCLC tissue sections. Staining intensity of theFFPE tissues was correlated with clinicopathological parameters.Altered Drosha cellular distribution was evident in neoplasia. The staining intensityof Drosha (p=0,03) was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal138tissues. When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, Drosha’sstaining intensity (p=0,002) was significantly lower. Drosha, protein levels were notsignificantly associated with age, tumor histology, grade or stage.Altered Dicer nuclear distribution was evident in lung neoplasia. The stainingintensity of Dice was significantly lower in neoplastic tissues stage I compared tonormal tissues (p=0,04). Dicer’s protein levels in FFPE tissues were significantlyassociated with tumor stage (p=0,049).AGO2 excibited physiological cytoplasmic distribution in lung neoplasia. Thestaining intensity of AGO2 was significantly lower in neoplastic tissues compared tonormal tissues (p=0,000). When we compared neoplastic tissue stage I with normaltissues, AGO2 staining intensity (p=0,000) was significantly lower. AGO2 proteinlevels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Ourfindings provide evidence that the miRNA machinery components Drosha, Dicer andAGO2 are involved in lung carcinogenesis but only Dicer is implicated in cancerprogression.The expression levels of the miRNA processing components might contribute toimproved cancerous molecular portraits for achieving personalized medicine, theselection of patient-tailored treatment regimens.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως.Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος του πνεύμονα είναι διαδικασία πολλαπλών σταδίων,στην οποία ενέχονται γενετικοί και επιγενετικοί μηχανισμοί. Ενεργοποίησηογκογονιδίων συμβαίνει σε όλους τους βρογχοπνευμονικούς καρκίνους μεαποτέλεσμα την αύξηση των μιτογόνων σημάτων. Στον καρκίνο του πνεύμονα τα πιοσυχνά ενεργοποιημένα ογκογονίδια είναι τα EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET,CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, και BCL2. Επίσης, η απώλειαογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ιδιαίτερα σημαντική στην πνευμονικήκαρκινογένεση και είναι συνήθως αποτέλεσμα απενεργοποίησης και των δυοαλληλόμορφων. Συχνά απενεργοποιημένα ογκοκατασταλτικά γονίδια στον καρκίνοτου πνεύμονα είναι TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT και PTEN. Οι επιγενετικοίμηχανισμοί περιλαμβάνουν την μεθυλίωση του DNA, την τροποποίηση των ιστονώνκαι τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω των microRNAs. Τα microRNAsείναι μικρά, μη κωδικοποιούντα μόρια RNA που εμπλέκονται στην αρνητική μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλοτων miRNAs στην φυσιολογική πνευμονική ανάπτυξη και ομοιόσταση αλλά και τονενεργό ρολό τους στην παθογένεια πνευμονικών νοσημάτων όπως είναι ο καρκίνοςτου πνεύμονα. Η δημιουργία ωρίμων, λειτουργικών microRNAs απαιτεί τησυντονισμένη δράση μιας ομάδας πρωτεϊνών που στο σύνολο τους απαρτίζουν τομηχανισμό ρύθμισης των microRNA (microRNA machinery). Ο μηχανισμός ελέγχουτων microRNA ρυθμίζει μέσω των παραγομένων microRNAs την έκφραση πολλώνογκοκατασταλτικών γονιδίων και ογκογονιδίων. Κύρια συστατικά του μηχανισμούρύθμισης των microRNA είναι οι ριβονουκλεάσες Drosha, Dicer και AGO2. Σκοπόςτης παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της κυτταρικής εντόπισης και έκφρασης τωνσυστατικών του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA, Drosha, Dicer και AGO2,135στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκε ηκυτταρική εντόπιση των Drosha, Dicer και AGO2 στις κυτταρικές σειρές καρκίνουτου πνεύμονα A549, H23, H358, H661, HCC827 με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού.Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Drosha invitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα επίπεδαανοσοέκφρασης της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα νεοπλασματικάκύτταρα NSCLC, σε σχέση με τα φυσιολογικά. Επίσης, τα κυτταρικά επίπεδα τηςDrosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με τοφυσιολογικό ιστό. Όμως, στατιστικά σημαντική διαφορά δεν προέκυψε από τηνσύγκριση καρκινικών ιστών μεταξύ τους κατά ιστολογικό τύπο, στάδιο νόσου καιβαθμό κακοήθειας. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν συμμετοχή της ριβονουκλεάσηςDrosha στην πνευμονική κακοήθη εξαλλαγή και στην παθογένεια του NSCLC αλλάόχι στην εξέλιξη της νόσου.Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Dicer invitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα πειράματαανοσοϊστοχημείας, ανέδειξαν ότι τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Dicer ήτανστατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό(p=0,040). Μάλιστα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στηνανοσοέκφραση της Dicer στην σύγκριση των τριών σταδίων μεταξύ τους (p=0,049)και αυτό το εύρημα παρουσιάζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία από τηνπαρούσα μελέτη. Όμως, τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονταιμε τον ιστολογικό τύπο αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Τα ευρήματα μας αυτάεισηγούνται τη συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Dicer στην πνευμονικήκαρκινογένεση και στην εξέλιξη της νόσου.Τέλος, τα κυτταρικά επίπεδα της ενδονουκλεάσης AGO2 είναι στατιστικάχαμηλότερα στα πνευμονικά νεοπλασματικά κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά. Ηπρωτεϊνική έκφραση των κυτταρικών σειρών NSCLC παρουσίασε σχεδόν136ομοιόμορφη κατανομή. Μάλιστα, και για την πρωτεΐνη AGO2 τα επίπεδαανοσοέκφρασης είναι στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με τοφυσιολογικό ιστό (p=0,000). Όμως, παρατηρήθηκε ότι τα κυτταρικά επίπεδα αυτήςτης πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο, το στάδιο της νόσου αλλά καιτο βαθμό της κακοήθειας. Το γεγονός αυτό ενισχύει την άποψη ότι η AGO2συμμετέχει στην παθοβιολογία του NSCLC αλλά πιθανά όχι στην εξέλιξη της νόσου.Εάν αποδειχθεί σημαντική η συμμετοχή του μηχανισμού ρύθμισης των microRNAστην παθογένεια της πνευμονικής κακοήθειας, θα υπάρξει η δυνατότητα ναχρησιμοποιηθούν για την δημιουργία υποομάδων («μοριακά πορτραίτα») τουκαρκίνου του πνεύμονα, οι οποίες να έχουν προγνωστική αλλά και θεραπευτική αξία(στοχευμένες θεραπείες)