Επίδραση των φαρμάκων για την πνευμονική υπέρταση στην έκφραση των γλυκοζαμινογλυκανών και μεταλλοπρωτεασών σε προωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων πνευμονικής αρτηρίας ανθρώπων

Abstract

This thesis concerns the investigation of the pathophysiology of idiopathic pulmonary hypertension (IPAH), a rare disease with very severe morbidity and a high mortality rate. During the last 20 years great progress has been achieved in understanding the pathophysiology of the disease, which includes the improvement of both the early diagnosis of patients and pharmacotherapy. The prevalent specific medication is based upon enhancing prostacyclin’s and nitrogen oxide’s action (e.g. sildenafil) as well as the inhibition of endothelin-1 (e.g. bosentani). One of the fields that remain to be explained is the contribution of the extracellular matrix molecules in tissue remodeling observed in IAPH, given that extracellular matrix (ECM) molecules such as glycosaminoglycans (GAG), proteoglycans (PG) and the connective tissue metalloproteases (MMP) involved in tissue remodeling and have been reported to be associated with other lung diseases that exhibit tissue remodeling. In the present study we investigated the role of GAG, PG and MMP in IPAH. The study was performed on homogenized lung tissue and on primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) obtained from 12 patients with IPAH and 10 healthy organ donors. The PASMCs were also investigated for the effect of drugs sildenafil and bosentani in the expression of GAG, PG and MMP, as well as the effect of the transforming growth factor-b1 (TGF-b1) and the bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). These two growth factors are key regulators of the synthesis of ECM molecules and they are directly involved in the pathophysiology of IPAH. This system is the closest simulation of an experimental model in tissue remodeling associated with IPAH. It was discovered that the samples of lung tissue and the PASMCs express the following GAGs: HA, heparan sulfate, dermatan sulfate and chondroitin sulfate. A statistically significant increase of HA and reduction of heparan sulfate, dermatan sulfate and chondroitin sulfate was observed in the lungs of patients with IPAH. Also, the molecular mass of HA in the healthy lung tissue was found over 1000 kDa, whereas HA from patients with IPAH was estimated at approximately 200 kDa. These differences in HA levels are owed to the modulation of expression of the enzymes that metabolize it. The samples of lung tissue and PASMCs express the enzymes that synthesize HA: Has1, Has2 and Has3 and the enzymes that degrade HA: Hyal1, Hyal2, Hyal3 and Hyal4, as well as the HA receptors: CD44 and Rhamm. The expression and protein levels of HAS1 are statistically significantly increased, whereas the expression of HYAL1 is reduced in patients with IPAH. The results support the theory that high molecular weight HA is associated with physiological processes, while the low molecular weight HA is associated with inflammatory conditions. In the experimental model simulation of tissue remodeling associated with IPAH, it was found that the addition of both TGF-b1, and BMP-2 in healthy PASMCs, causes dose-dependent and time-dependent modulation of the expression of GAGs, HA and HAS-1, similar to that observed in patients with IPAH. The intracellular signaling of TGF-b1 in the de novo synthesis, secretion and deposition of GAGs from PASMCs was discovered to be mediated via the SMAD and p38 MAPK signaling pathways. Regarding the proteoglycans, both the healthy and patient samples of lung tissue, as well as the PASMCs, were found to express versican, biglycan, decorin, syndecan and perlekani. Apart from that, a statistically significant reduction in the expression of versican V1 and decorin was discovered in the patients with IPAH. It was also found that TGF-b1 induces in a dose-dependent and time-dependent manner the expression of versican V0 and V1, biglycan, syndecan and perlekanis and reduces the expression of decorin. Similarly, the BMP-2 induces a time-dependent induction in the expression of versican V0, versican V1, perlekanis and syndecan. The induction of expression of specific proteoglycans caused by TGF-b1 and BMP-2 may be related to the reconstruction of lung tissue observed in IPAH. Regarding the influence of drugs sildenafil and bosentani they were found to not significantly affect the levels HA, the expression of Has, Hyal, CD44 and RHAMM and the activity levels and MMP and TIMP in PASMCs. However, these drugs, either alone or combined reduce the TGF-b1 or BMP-2 induced gene expression of proteoglycans versican V0, versican V1, biglycan, syndecan and perlekanis in PASMCs, but the reduction is not statistically significant. The results of the present study indicate that the extracellular matrix molecules such as glycosaminoglycans, particularly hyaluronic acid, proteoglycans, and gelatinases are involved in the pathophysiology of IPAH and could be potential pharmacological targets for the treatment of this incurable and fatal disease. The effect of drugs sildenafil and bosentani, administered in IPAH, indicates potential beneficial effects due to the induced return to normal levels of gene expression of proteoglycans, but the statistical significance remains to be proved on a larger number of patients.

Η παρούσα διατριβή αφορά στη διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της ιδιοπαθούς πνευμονικής υπέρτασης (IPAH), μιας σπάνιας ασθένειας με ιδιαίτερα βαρεία νοσηρότητα και θνητότητα. Κατά την τελευταία 20ετία έχει επιτευχθεί μεγάλη πρόοδος όσον αφορά στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου, η οποία αντικατοπτρίζεται στη βελτίωση της έγκαιρης διάγνωσης των ασθενών και της φαρμακοθεραπείας. Η επικρατούσα ειδική φαρμακευτική αγωγή βασίζεται κατά κύριο λόγο στην ενίσχυση της δράσης του ΝΟ (π.χ. σιλδεναφίλη) και της προστακυκλίνης και στην αναστολή της δράσης της ενδοθηλίνης-1 (π.χ. μποσεντάνη). Ένα από τα πεδία που παραμένει ακόμη να διευκρινιστεί είναι η συμβολή των μορίων του εξωκυττάριου χώρου στην ιστική αναδόμηση που παρατηρείται στην IAPH, δεδομένου ότι μόρια του εξωκυττάριου χώρου όπως οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAG), οι πρωτεογλυκάνες (PG) και οι μεταλλοπρωτεάσες του συνδετικού ιστού (MMP) εμπλέκονται στην ιστική αναδόμηση και έχει αναφερθεί ότι σχετίζονται με άλλες παθήσεις των πνευμόνων που εμφανίζουν ιστική αναδόμηση. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος των GAG, PG και MMP στην IPAH. Η μελέτη έγινε σε ομογενοποιημένο πνευμονικό ιστό και σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων από πνευμονικές αρτηρίες (pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC) που ελήφθησαν από 12 ασθενείς με IPAH και από 10 υγιείς δότες οργάνων. Στα PASMC μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση των φαρμάκων μποσεντάνη και σιλδεναφίλη στην έκφραση των GAG, PG και MMP, καθώς και η η επίδραση του μετασχηματίζοντος αυξητικού παράγοντα-β1 (TGF-β1) και της μορφογενετικής πρωτεΐνης των οστών-2 (BMP-2). Οι 2 αυτοί αυξητικοί παράγοντες αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της σύνθεσης μορίων του ECM και εμπλέκονται άμεσα στην παθοφυσιολογία της IPAH. Το σύστημα αυτό αποτελεί την πλέον κοντινή προσομοίωση σε πειραματικό μοντέλο της αναδιαμόρφωσης των ιστών που σχετίζεται με την IPAH. Διαπιστώθηκε ότι τα δείγματα πνευμονικού ιστού και τα PASMC εκφράζουν τις GAG: ΗΑ, θειική ηπαράνη, θειική δερματάνη και θειική χονδροϊτίνη. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση του ΗΑ και μείωση της θειικής ηπαράνης, θειικής δερματάνης και θειικής χονδροϊτίνης στους πνεύμονες ασθενών με IPAH. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι η μοριακή μάζα του ΗΑ από πνευμονικό ιστό από μάρτυρες έχει ΜΒ μεγαλύτερο από 1000 kDa, ενώ το ΗΑ από ασθενείς με IPAH υπολογίσθηκε σε περίπου 200 kDa. Οι διαφορές αυτές στα επίπεδα ΗΑ οφείλονται στη διαφοροποίηση της έκφρασης των ενζύμων που μεταβολίζουν το ΗΑ. Τα δείγματα πνευμονικού ιστού και PASMC εκφράζουν τα ένζυμα που συνθέτουν το ΗΑ: Has1, Has2 και Has3 καθώς και τα ένζυμα που αποδομούν το ΗΑ: Hyal1, Hyal2, Hyal3 και Hyal4, καθώς και τους υποδοχείς του ΗΑ CD44 και Rhamm. Η έκφραση και τα επίπεδα πρωτεΐνης της HAS1 είναι στατιστικά σημαντικά αυξημένη, ενώ η έκφραση της HYAL1 είναι στατιστικά σημαντικά μειωμένη στους ασθενείς με IPAH. Τα αποτελέσματα ενισχύουν τη θεωρία ότι το ΗΑ μεγάλου μοριακού βάρους σχετίζεται με φυσιολογικές διεργασίες, ενώ το μικρού μοριακού βάρους ΗΑ με φλεγμονώδεις καταστάσεις. Στο πειραματικό μοντέλο προσομοίωσης της αναδιαμόρφωσης των ιστών που σχετίζεται με την IPAH, διαπιστώθηκε ότι η προσθήκη τόσο του TGF-β1, όσο και της BMP-2 σε φυσιολογικά PASMC, προκαλούν δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη διαφοροποίηση της έκφρασης GAG, HA και HAS-1, παρόμοια με αυτήν που παρατηρήθηκε σε ασθενείς με IPAH. Η ενδοκυττάρια μετάδοση σήματος του TGF-β1 στη de novo σύνθεση, έκκριση και εναπόθεση GAG από PASMC διαπιστώθηκε ότι μεσολαβείτε μέσω SMAD και p38 MAPK σηματοδοτικών μονοπατιών. Σε σχέση με τις πρωτεογλυκάνες, διαπιστώθηκε ότι τα δείγματα πνευμονικού ιστού μαρτύρων και ασθενών με IPAH καθώς και τα PASMC εκφράζουν τη βερσικάνη, διγλυκάνη, ντεκορίνη, περλεκάνη και συνδεκάνη και παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση βερσικάνης V1 και της ντεκορίνης στους ασθενείς με IPAH. Διαπιστώθηκε, επίσης, ότι ο TGF-β1 επάγει κατά δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο τρόπο την έκφραση της βερσικάνης V0 και V1, διγλυκάνης, περλεκάνης και συνδεκάνης και μειώνει την έκφραση της ντεκορίνης. Παρόμοια, διαπιστώθηκε ότι η BMP-2 προκαλεί χρονοεξαρτώμενη επαγωγή της έκφρασης της βερσικάνης V0 και V1, της περλεκάνης και της συνδεκάνης. Η επαγωγή της έκφρασης των συγκεκριμένων πρωτεογλυκανών που προκαλεί ο TGF-β1 και η BMP-2 ενδεχομένως σχετίζεται με την αναδόμηση του πνευμονικού ιστού που παρατηρείται στην IPAH. Όσον αφορά στην επίδραση των φαρμάκων σιλδεναφίλη και μποσεντάνη, διαπιστώθηκε ότι δεν επηρεάζουν σημαντικά στα PASMC τα επίπεδα HA, την έκφραση Has, Hyal, CD44 και RHAMM και τη δραστηριότητα και επίπεδα MMP και TIMP. Διαπιστώθηκε, όμως ότι τα εν λόγω φάρμακα ή ο συνδυασμός τους μειώνουν την επαγόμενη από τον TGF-β1 ή την BMP-2 έκφραση των γονιδίων των πρωτεογλυκανών βερσικάνης V0, βερσικάνης V1, διγλυκάνης, περλεκάνης και συνδεκάνης στα PASMC, αλλά η μείωση αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική. Τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής υποδεικνύουν ότι τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως οι γλυκοζαμινογλυκάνες και ιδιαίτερα το υαλουρονικό οξύ, οι πρωτεογλυκάνες και οι ζελατινάσες εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της IPAH και θα μπορούσαν να αποτελέσουν δυνητικούς φαρμακολογικούς στόχους στην αντιμετώπιση της ανίατης και θανατηφόρου αυτής ασθένειας. Η επίδραση των φαρμάκων σιλδεναφίλη και μποσεντάνη, τα οποία χορηγούνται στη IPAH, υποδεικνύει ενδεχόμενα ευεργετικά αποτελέσματα λόγω της προκαλούμενης επαναφοράς σε φυσιολογικά επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης των πρωτεογλυκανών, αλλά η στατιστική τους σημαντικότητα παραμένει να αποδειχθεί σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών.