Ανάλυση του βιολογικού ρόλου των μικρών RNA σε ζωικά πειραματικά πρότυπα φλεγμονοδών ασθενειών του ανθρώπου

Abstract

Objective:Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic systemic inflammatory diseasecharacterised by synovial hyperplasia and consequent formation offibrous tissue termed pannus, cartilage degradation and bone erosionwith bone fusion. Synovial fibroblasts (SFs) are widely recognized as akey cell type mediating RA pathogenesis. The purpose of the thesiswas to identify novel microRNA (miR) associations in synovialfibroblasts (SFs), by performing miR expression profiling on cellsisolated from the human TNF transgenic mouse model (TghuTNF,Tg197) and patients biopsies, and analyse their function in vitro and invivo.Methods:miR expression was determined by miR deep sequencing (miR-seq)and the arthritic profile was established by pairwise comparisons. qPCRanalysis was utilised for profile validation, miR and gene quantitation inpatient SFs. Dysregulated miR target genes and pathways werepredicted via bioinformatic algorithms and validated using gain-offunctioncoupled with reporter assays experiments. The in vivo funtionof miRs was assessed by using knock-out mice.Results:miR-seq demonstrated that TghuTNF-SFs exhibit a distinct pathogenicprofile with 22 significantly upregulated and 30 significantlydownregulated miRs. Validation assays confirmed the dysregulation ofmiR-223, miR-146a and miR-155 previously associated with humanrheumatoid arthritis (RA) pathology, as well as that of miR-221/222 andmiR-323-3p. Notably, the latter were also found significantly upregulatedin patient RASFs, suggesting for the first time their association with RApathology.Complete deletion of miR-155 from Tg197 mice had no affect on SFactivation or arthritis development in these mice.In vitro gain and loss of function experiment, coupled with functionalassay results suggested that miR-221/222 is a TNF responsive miRcluster that targets P27 and PTEN and regulates the cell cycle inarthritic SF.Bioinformatic analysis suggested Wnt/Cadherin signaling as a putativepathway target. miR-323-3p overexpression was shown to enhance Wntpathway activation and decrease the levels of its predicted target BTRC,an inhibitor of β-catenin.Conclusions:Using miR-seq based profiling in SFs from the TghuTNF mouse modeland validations in RA patient biopsies, we identify miR-221/222 andmiR-323-3p as novel dysregulated miRs in RASFs. Furthermore, weshow that miR-323-3p is a positive regulator of WNT/cadherin signalingin RASFs suggesting its potential pathogenic involvement and futureuse as a therapeutic target in RA.

Σκοπός:Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ), μια χρόνια συστημικήφλεγμονώδης ασθένεια, επηρεάζει κατά κύριο λόγο τις διαρθρώσεις. Ηπαρούσα μελέτη επικεντρώνεται ειδικότερα στους αρθρικούςινοβλάστες, κυτταρικός τύπος που συμβάλλει σημαντικά στηνπαθογένεια της ασθένειας.Ο διαγονιδιακός ποντικός Tg197, έχει αναγνωριστεί ως ζωικόπειραματικό πρότυπο ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Επίσης, πρόσφαταβρέθηκε ότι τα μίκροRNA (miRNA), ρυθμίζουν μια πληθώρα βασικώνκυτταρικών λειτουργιών και μπορούν να αποτελέσουν δυνητικάσημαντικούς θεραπευτικούς στόχους.Έτσι επιλέξαμε να συγκρίνουμε τα επίπεδα έκφρασης των miRNA σεTg197 αρθριτικούς ινοβλάστες, να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματα σεαρθρικούς ινοβλάστες ασθενών με ΡΑ και τέλος να αναλύσουμε τονπιθανό ρόλο των απορρυθμισμένων miRNA στους μηχανισμούς τηςπαθογένειας in vitro και in vivo.Μεθοδολογία:Τα επίπεδα έκφρασης των miRNA ταυτοποιήθηκανχρησιμοποιώντας την τεχνική «βαθιάς» αλληλούχισης καιεπιβεβαιώθηκαν μέσω ποσοτικής αντίδρασης αλυσιδωτήςπολυμεράσης. Πρόβλεψη του πιθανού ρόλου των miRNA επιτεύχθηκεμέσω χρήσης βιοπληροφορικών αλγορίθμων. Ο ρόλος των miRNA σεαρθρικούς ινωβλάστες διερευνήθηκε μέσω in vitro πειραμάτων και ορόλος τους υπο φυσιολογικές και αρθριτικές συνθήκες διερευνήθηκεμέσω της χρήσης διαγονιδιακών ποντικών.Αποτελέσματα:Ανάλυση της έκφρασης miRNA (miRNA προφίλ) των Tg197αρθρικών ινοβλαστών, έδειξε πως 22 miRNA υπερεκφράζονται και 30miRNA παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση στους Tg197 αρθρικούςινοβλάστες. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε η απορρύθμιση των miR-223,miR-146a και miR-155, η έκφραση των οποίων έχει βρεθεί ήδηαπορρυθμισμένη σε ασθενής με ΡΑ , καθώς και ότι απ ορρυθμισμέναείναι και τα miR-221/222 και miR-323-3. Αξιοσημείωτα, μετρήσεις τωνεπιπέδων miR-221/222 και miR-323-3p σε δείγματα ασθενώνεπιβεβαίωσαν την απορρύθμισή, συνδέοντας έτσι για πρώτη φορά αυτάτα miRNA με τους μηχανισμούς της ανθρώπινης ασθένειας.Κλινικές και ιστοπαθολογικές μελέτες έδειξαν πως η συνολικήαδρανοποίηση του miR-155 σε Tg197 ποντικούς δεν ήταν ικανή ναεπηρεάσει ούτε την ενεργοποίηση των Tg197 αρθρικών ινοβλαστώντους, ούτε να μεταβάλει την πορεία της ασθένειας τους.Ιn vitro πειράματα έδειξαν πως η έκφραση του miR-221/222 μπορείνα επαχθεί από τον TNF και η υπερέκφραση του miR-221/222 έχει ώςαποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης των προτεϊνών P27 και PTENκαι την επιτάχυνση του κυτταρικού κύκλου.Τέλος, βιοπληροφορικές αναλύσεις πρ οέβλεψαν το σημ ατοδοτικόμονοπάτι WNT/Cadherin ως πιθανό στόχο του miR-323-3p. In vitroπειράματα επιβεβαίωσαν τις προβλέψεις, δείχνοντας πως ηυπερέκφραση του miR-323-3p ενίσχυσε την ενεργοποίηση του WNTμονοπατιού και κατάφερε να αναστείλει την έκφραση του αναστολέα τηςβ-CATENIN, BTRC.Συμπέρασματα:Εν κατακλειδι, η μεθοδολογία που εφαρμόστηκε στην παρούσαδιατριβή, κατάφερε να ταυτοποιήσει τρία καινούργια miRNA, τα miR-221-222 και miR-323-3p, αναδεικνύοντας τα έτσι σε νέους πιθανούςθεραπευτικούς στόχους.