Μοριακές ενδείξεις για τις διεργασίες αναγνώρισης του αντιγόνου στη β-χρόνια λεμφογενή λευχαιμία: ενδοκλωνική ετερογένεια γονιδίων της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών

Abstract

The molecular analysis of immunoglobulins (IGs) expressed by chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells strongly indicates a role for antigenic stimulation through the B-cell antigen receptor (BcR) at some point(s) in the natural history of the disease. Evidence for continuously antigenic stimulation, is the ongoing activity of somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) processes. Activation-induced cytidine deaminase (AID), is critically implicated in both SHM and CSR processes. AID is expressed in normal B lymphocytes as a native transcript and as several splice variants, with as yet undefined roles. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) leukemic B cells have also been shown to express AID transcripts, especially in cases with unmutated immunoglobulin (IG) genes. Therefore, AID expression in CLL might potentially be relevant to continuously antigenic stimulation of clonogenic cells. The available data on AID-mRNA splicing patterns in CLL are limited and conflicting. In the present study, we investigated AID-mRNA isoform expression in a series of 195 CLL patients and explored associations with IGHV gene mutational status, isotype sIg expression and presence of isotype switched IG transcripts. In the present study, we detected 3 alternative AID transcripts, full length AID transcript (AID-FL) and two splice variants (AID-ΔE4a and AID-ΔE4) in 110/91/95 cases, respectively. AID transcript levels ranged considerably up to 3 logs, with a continuous distribution between different cases, whereas, the CLL leukemic clones were not distinguished by a “disease-biased” pattern of AID mRNA expression. We found a significantly higher frequency of AID mRNA positivity (at least one type of AID transcript) in cases carrying unmutated vs. mutated IGHV genes (78,4% in unmutated vs. 56.2% in mutated cases). In addition, co-expression of all three AID-mRNA isoforms was significantly more frequent in cases carrying unmutated vs mutated IGHV genes (p<0.001). No significant differences were identified between sIgG+ vs. sIgMD+ cases regarding the frequency of AID-mRNA expression. However, expression of at least one AID-mRNA isoform predominated among mutated IgG+ vs mutated IgMD+ cases (p=0.05). AID transcripts were detected in almost all cases (14/16) with isotype switched IG transcripts. Interestingly, 10/16 cases carried unmutated IGHV genes. This different action of AID on SHM and CSR in unmutated CLL cells is indicative of the different mechanisms responsible for SHM and CSR activation. AID mRNA expression patterns were not found to be associated with either PFS or OS. In conclusion, the high frequency of of AID mRNA positivity in CLL is indicative of continuously antigenic stimulation of the CLL clone. However, the observed variability regarding both individual transcript levels and co-expression of different splice variants may be considered as further evidence that CLL is a heterogeneous disease and justifies subset analysis in groups of cases defined by certain biological features. The significantly higher frequency of AID mRNA positivity in cases carrying unmutated IGHV genes is indicative of functional inactivation of AID or may be due to defects in other yet unidentified factors that are critical for SHM.

Η ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών (IGs) στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) στηρίζει ισχυρά την υπόθεση της ενεργού συμμετοχής του Β-κυτταρικού υποδοχέα (BcR) -μέσω της επιλογής από αντιγόνο- σε κάποια φάση της λευχαιμογένεσης. Σημαντικές ενδείξεις για τη συνεχιζόμενη αντιγονική διέγερση αποτελεί η διατήρηση ενεργού του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης (ΣΥΜ) και της μεταστροφής ισοτύπου (ΜΙ). Η δεαμινάση της κυτιδίνης (ΑΙD), παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στη ΣΥΜ όσο και τη ΜΙ. Η AID εκφράζεται στα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα ως πλήρες λειτουργικό μόριο και ως εναλλακτικά μετάγραφα με αδιευκρίνιστο μέχρι σήμερα ρόλο. Επιπλέον, η AID εκφράζεται συχνά στα νεοπλασματικά λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ ιδιαίτερα σε περιπτώσεις με αμετάλλακτα IGHV γονίδια. H έκφραση της AID στη ΧΛΛ ενδεχόμενα σχετίζεται με συνεχιζόμενη αντιγονική διέγερση των νεοπλασματικών λεμφοκυττάρων. Τα διαθέσιμα βιβλιογραφικά δεδομένα όσον αφορά τα πρότυπα έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων της AID στη ΧΛΛ είναι περιορισμένα και αλληλοσυγκρουόμενα. Στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε την έκφραση των εναλλακτικών μεταγράφων της AID σε 195 ασθενείς με ΧΛΛ και αναζητήσαμε τυχόν συσχετίσεις με το φορτίο μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV, τον ισότυπο της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης των νεοπλασματικών κυττάρων και την παρουσία ισοτυπικών μεταγράφων ΙG. Στο σύνολο των περιπτώσεων ΧΛΛ που μελετήθηκαν, ανιχνεύτηκαν 3 εναλλακτικά μετάγραφα AID, το πλήρες μετάγραφο της AID (AID-FL) και δύο εναλλακτικές ισομορφές (ΑID-ΔE4a, AID-ΔE4) σε 110/91/95 περιπτώσεις, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε σημαντικού βαθμού διακύμανση της έκφρασης μέχρι και 3 logs μεταξύ των διαφορετικών περιπτώσεων με μια συνεχή κατανομή των τιμών και για τα τρία μετάγραφα ενώ δεν παρατηρήθηκαν ειδικά για τη νόσο πρότυπα έκφρασης των μεταγράφων AID. Βρέθηκε αυξημένη συχνότητα έκφρασης ενός τουλάχιστον μεταγράφου AID στους αμετάλλακτους (78,4% στους αμετάλλακτους, 56,2% στους μεταλλαγμένους). Επιπλέον, συνέκφραση και των τριών ισομορφών της AID βρέθηκε συχνότερα σε περιπτώσεις με αμετάλλακτα γονίδια IGHV (p<0.001). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα έκφρασης των μεταγράφων AID μεταξύ των sIgG+ και των sIgMD+ περιπτώσεων. Εντούτοις, η έκφραση ενός τουλάχιστον μεταγράφου AID ήταν συχνότερη στις μεταλλαγμένες sIgG+ έναντι των μεταλλαγμένων sIgMD+ περιπτώσεων σε βαθμό στατιστικά σημαντικό (p=0.05). Έκφραση της AID παρατηρήθηκε σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις (14/16) που έφεραν πολλαπλά ισοτυπικά μετάγραφα IG. Επιπλέον, οι 10/16 περιπτώσεις με πολλαπλά μετάγραφα IG έφεραν αμετάλλακτα IGHV γονίδια. Σε αυτές τις περιπτώσεις φαίνεται ότι η AID διατηρεί ενεργό το μηχανισμό της ΜΙ ενώ η ΣΥΜ παραμένει ανενεργός γεγονός ενδεικτικό των διαφορετικών μηχανισμών ενεργοποίησης της ΜΙ και της ΣΥΜ. Δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση των μοτίβων έκφρασης των AID mRNA με την PFS ή την OS. Συμπερασματικά, η συχνή ανίχνευση μεταγράφων AID είναι ενδεικτική συνεχιζόμενης αντιγονικής διέγερσης του νεοπλασματικού κλώνου. Επιπλέον, η παρατηρηθείσα ευρεία διακύμανση τόσο των επιπέδων έκφρασης όσο και των διαφορετικών προτύπων έκφρασης των εναλλακτικών μεταγράφων, μπορεί να θεωρηθούν ως περαιτέρω ενδείξεις για την ετερογένεια της ΧΛΛ και επιβάλλουν την ανάγκη διάκρισης υποομάδων ασθενών με ιδιαίτερα βιολογικά χαρακτηριστικά. Η αυξημένη συχνότητα έκφρασης της AID σε περιπτώσεις που φέρουν αμετάλλακτα γονίδια IGHV έναντι αυτών που φέρουν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV είναι ενδεικτική είτε λειτουργικής αδρανοποίησης της AID είτε ανεπάρκειας αγνώστων μέχρι σήμερα παραγόντων απαραίτητων για τη ΣΥΜ.