The role of the E(spl) bHLH-Orange genes in Tribolium castaneum embryogenesis

Abstract

E(spl)/Hes bHLH-Orange proteins belong to the large family of bHLH proteins and play important roles in a plethora of developmental processes throughout metazoa. The proteins consist of the characteristic bHLH domain, of which the basic domain serves for DNA binding and the HLH region for homo- or heterodimerization among bHLH proteins. The additional Orange domain and the c-terminal WRPW motif are characteristics of the E(spl)/Hes proteins and group them in bHLH sub group E. The proteins act as repressors by binding to a specific DNA consensus, the EB box (CACGTG) or variants thereof the C (CACGCG) and N (CACNAG) box present in target gene enhancers and by direct protein-protein interaction with the proneural proteins of sub group A. Repression is frequently mediated through Notch signalling, as such in Drosophila embryonic neurogenesis in the process of lateral inhibition and in vertebrate somitogenesis, where Notch signalling drives the so-called segmentation clock. Despite their importance in Drosophila and Vertebrate development E(spl) homologues have not been studied in other arthropods beside Drosophila. This study presents a detailed analysis of E(spl) function in the embryonic development of Tribolium castaneum, a coleopteran insect with a more basal phylogenetic position than the fruitfly Drosophila. The Tribolium genome contains of two E(spl) homologues we confer to as E(spl)1 and E(spl)3, which are arranged in a complex intermingled with a bearded family homolog and four further genes. Numerous Su(H) binding sites and miRNA binding sites (k-box and brd-box) are present in the regulatory regions of all complex genes indicating that they are Notch responsive. Concerning the protein structure the two proteins are identical in the bHLH region, which is also very similar to the Drosophila E(spl) proteins mγ and mβ. The Orange domain is more divers between Tc E(spl)1 and Tc E(spl)3 and only Tc E(spl)1 shows good sequence similarity to Dm mγ/mβ. During embryogenesis Tc E(spl)1 and Tc E(spl)3 are expressed similarly in the ventral neuroectoderm (VNC) in a lateral inhibition reflecting pattern. Expression temporally and spatially broadly coincides with proneural Tc ASH expression and precedes ase expression in neuroblasts, spatially how ever, Tc ASH and Tc E(spl) expression is different: E(spl) is excluded from newly born neuroblasts and is instead expressed in circles of cells surrounding a central neuroblasts. Additionally E(spl)1 is expressed in the very posterior of the growth zone. Indeed, in agreement with a role in lateral inhibition, functional studies reveal that the E(spl) genes are regulated by Notch and as well by proneural activity. The knock down of Notch function leads to a neurogenic phenotype, lateral inhibition is abolished and whole pro neural clusters obtain the neuroblast fate. As such in Tribolium neurogenesis Notch driven lateral inhibition is the process used to pattern the embryonic VNC. Defects in the abdominal region indicate a further role of Notch. We could show that expression of the mesoderm determinant twist is disturbed in Notch RNAi embryos and that segmental engrailed stripes are frequently following in short distance suggesting a role of Notch signalling in segmental patterning. The double knock down of E(spl)1 and E(spl)3 is similar to the Notch knock down suggesting that indeed lateral inhibition involves E(spl) function although single E(spl)1 or E(spl)3 knock downs are not sufficient to produce neurogenic phenotypes. E(spl)1 RNAi does not have an effect on embryonic development while E(spl)3 RNAi results in severe abdominal phenotypes, with a disturbed twist expression similarly to loss of Notch function. Abdominal phenotypes are frequent and similar to the ones produced by Notch RNAi what indicate that segmental patterning during germband extension requires Notch mediated activity of the E(spl) genes. E(spl)3 is the main player in segmental patterning acting and E(spl)1 function seems to be dispensable in this process. This data strongly supports a conservation of lateral inhibition between Tribolium and Drosophila and the analysis of Tribolium E(spl) protein function in the fly system and in cell transfection assays reveals further conservation between species. Tribolium E(spl)1 and E(spl)3 transgenes ectopically expressed in the fly are sufficient repressors in two well-known E(spl) dependent aspects of imaginal development (a) the specification of external sensory organs, namely notum microand macro chaetae and anterior wing margin bristles; and (b) the formation of wing veins. Reporter assays reveal that the Tribolium proteins can use both; direct DNA binding and protein-protein interaction with DNA bound proneural proteins for repression. Tribolium E(spl)1 and E(spl)3 both interact sufficiently with the transactivation domain of the Drosophila proneural protein Scute but only E(spl)1 has the ability to interact with the proneural heterodimerization partner Daughterless. This reflects the sequence diversity in the Orange domain, where only Tc E(spl)1 is similar to the Drosophila E(spl) proteins interacting with Daughterless. E(spl)3 is a strong repressor in all applied assays showing that this interaction is dispensable, a fact also observed in Drosophila.

Οι πρωτεΐνες E(spl)/Hes bHLH-Orange είναι μια υποκατηγορία της οικογένειας των bHLH μεταγραφικών παραγόντων με σημαντικούς ρόλους σε πληθώρα αναπτυξιακών διαδικασιών των μεταζώων. Η χαρακτηριστική bHLH δομική περιοχή τους αποτελείται από ένα βασικό τμήμα (b: basic) που χρησιμεύει για πρόσδεση στο DNA και μια HLH (Helix-Loop-Helix) περιοχή απαραίτητη για ομο- ή ετεροδιμερισμό. Η επιπρόσθετη περιοχή Orange (επιφάνεια αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεïνών) και το καρβοξυτελικό WRPW αμινοξικό μοτίβο (αλληλεπίδραση με συγκαταστολείς της μεταγραφής) αποτελούν χαρακτηριστικά των E(spl)/Hes πρωτεϊνών και τις κατατάσσουν στην υπο-ομάδα Ε των bHLH. Οι εν λόγω πρωτεΐνες δρουν ως μεταγραφικοί καταστολείς προσδενόμενες στο μοτίβο EB (CACGTG) και σε παραλλαγές αυτού (CACGCG και CACNAG) που εντοπίζονται σε ενισχυτές γονιδίων-στόχων. Για τη ρύθμιση της μεταγραφής οι E(spl)/Hes bHLH-Orange αλληλεπιδρούν με προνευρικές πρωτεΐνες της ομάδας Α. Η καταστολή συχνά διαμεσολαβείται από το μονοπάτι σηματοδότησης Notch, όπως για παράδειγμα κατά την διαδικασία της πλευρικής αναστολής στην εμβρυϊκή νευρογένεση της Δροσόφιλας ή κατά τη ρυθμική σωμιτογένεση των σπονδυλωτών. Παρά την σημασία τους στην ανάπτυξη της Δροσόφιλας και των σπονδυλωτών, τα ομόλογα των E(spl) πρωτεϊνών δεν έχουν μελετηθεί σε άλλα αρθρόποδα. Σε αυτή την εργασία μελετήσαμε λεπτομερώς την λειτουργία των E(spl) κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του κολεόπτερου εντόμου Tribolium castaneum, το οποίο έχει μία πιο “βασική” φυλογενετική τοποθέτηση από τη Δροσόφιλα. Το γονιδίωμα του Tribolium κωδικοποιεί δύο ομόλογα των E(spl), τα οποία ονομάζουμε Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται σε συνεχή διάταξη στο γονιδίωμα μαζί με ένα ομόλογο της οικογένειας bearded και τέσσερα ακόμα γονίδια, οι ρυθμιστικές περιοχές των οποίων περιλαμβάνουν πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Su(H), καθώς επίσης και θέσεις πρόσδεσης miRNA (k-box και brd-box) που δείχνουν ότι αποκρίνονται στο Notch. Η δομή των δύο πρωτεϊνών είναι πανομοιότυπη στην περιοχή bHLH και πολύ καλά συντηρημένη με τα δροσοφιλικά ομόλογα E(spl) mγ και mβ. Η περιοχή Orange διαφέρει περισσότερο μεταξύ των Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 και μόνο η Tc E(spl)1 δείχνει ομολογία με τις Δροσοφιλικές mγ και mβ. Κατά την εμβρυογένεση τα Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 έχουν παρόμοια έκφραση στο κοιλιακό νευροεκτόδερμα (VNC) σε ένα πρότυπο που αντικατοπτρίζει την πλευρική αναστολή. Η ευρεία έκφρασή τους συμπίπτει χωροχρονικά με την έκφραση του Tc ASH και προηγείται της έκφρασης του ase στους νευροβλάστες. Εντούτοις η έκφραση των Tc E(spl) και Tc ASH διαφέρει καθώς η έκφραση των E(spl) δεν εντοπίζεται στον κεντρικό νευροβλάστη αλλά περιορίζεται στα κύτταρα που τον περιβάλλουν. Επιπροσθέτως, το Tc E(spl)1 εκφράζεται στο οπίσθιο άκρο της ζώνης ανάπτυξης. Άρα σύμφωνα με το ρόλο τους στην πλευρική αναστολή, οι λειτουργικές μας μελέτες δείχνουν ότι τα γονίδια Tc E(spl) ρυθμίζονται τόσο από το Notch όσο και από τη δράση των προνευρικών γονιδίων. Συγκεκριμένα, η μείωση της δράσης του Notch οδηγεί σε νευρογόνο φαινότυπο, η πλευρική αναστολή καταστέλλεται και οι προνευρικοί συναθροισμοί αποκτούν την αναπτυξιακή τύχη του νευροβλάστη. Κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο Tribolium η ρυθμιζόμενη από Notch πλευρική αναστολή καθορίζει το πρότυπο του εμβρυϊκού VNC. Επιπλέον, ανωμαλίες στην κοιλιακή περιοχή δείχνουν έναν επιπρόσθετο ρόλο του Notch. Δείξαμε ότι η έκφραση του twist, που καθορίζει τη μεσοδερμική τύχη, αλλάζει σε Notch RNAi έμβρυα και οι μεταμερείς λωρίδες έκφρασης του engrailed ακολουθούν σε κοντινή απόσταση υποδεικνύοντας ένα ρόλο του Notch στην μεταμεριδίωση. Παρά το ότι ταυτόχρονη μείωση της δράσης των E(spl)1 and E(spl)3 προσομοιάζει την μείωση του Notch υποδεικνύοντας ότι η πλευρική αναστολή διαμεσολαβείται από τα E(spl), είδαμε ότι μείωση της δράσης του κάθε γονιδίου μεμονωμένα ήταν ικανή να δώσει νευρογόνους φαινότυπους. Το E(spl)1 RNAi δεν έχει καμία επίδραση στη εμβρυϊκή ανάπτυξη, ενώ το E(spl)3 RNAi προκαλεί έντονους κοιλιακούς φαινοτύπους με αλλαγή στην έκφραση του twist παρόμοια με το Notch RNAi. Οι κοιλιακοί φαινότυποι παρουσιάζουν παρόμοια συχνότητα και διεισδυτικότητα με αυτούς που προκαλούνται από το Notch RNAi, γεγονός που υποδεικνύει ότι η φυσιολογική μεταμερική ανάπτυξη επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης ενεργότητας των E(spl) από το Notch. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το E(spl)3 είναι ο κύριος ρυθμιστής σε αυτή τη διαδικασία, ενώ το E(spl)1 δεν είναι απολύτως απαραίτητο. Τέλος, εκφράσαμε εκτοπικά διαγονίδια Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 στη Δροσόφιλα και είδαμε ότι και τα δύο αποτελούν δραστικούς καταστολείς σε δύο καλά χαρακτηρισμένα συστήματα στους αναπτυξιακούς δίσκους των φτερών: (α) στον καθορισμό των εξωτερικών αισθητηρίων οργάνων, δηλαδή των μικρο- και μακροχαιτών του θώρακα και των χαιτών του εμπρόσθιου περιθωρίου του φτερού, και (β) στη δημιουργία των φλεβώσεων του φτερού. Επιπλέον, πειράματα σε κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες του Tribolium μπορούν να δράσουν τόσο με απ’ευθείας πρόσδεση στο DNA, όσο και αλληλεπιδρώντας με προνευρικές πρωτεΐνες που προσδένονται στο DNA. Οι Tc E(spl)1 και Tc E(spl)3 αλληλεπιδρούν με την ενεργοποιητική περιοχή της προνευρικής πρωτεΐνης Scute, αλλά μόνο η Tc E(spl)1 έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Daughterless. Αυτό καταδεικνύει την αμινοξική διαφοροποίηση της περιοχής Orange που κάνει το Tc E(spl)1 να μοιάζει με τις E(spl) της Δροσόφιλας που έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με Daughterless. Παρότι το Tc E(spl)3 δεν αλληλεπιδρά με Daughterless, είναι ένας ισχυρός καταστολέας σε όλες τις περιπτώσεις που ελέγχθηκαν υποδεικνύοντας ότι η αλληλεπίδραση αυτή δεν είναι απαραίτητη για καταστολή, όπως συμβαίνει και στη Δροσόφιλα.