Ανάπτυξη μεθόδων για τον προσδιορισμό ξενοβιοτικών ουσιών σε τρόφιμα για βρέφη και παιδιά μικρής ηλικίας

Abstract

The industrialization of the primary production and the recent advances in food science regarding foods for infants and young children, was implemented though the adoption of a variety of new technologies, whose negative outcome was the introduction of a wide range of toxic compounds in the food chain. The presence of these compounds is not normally expected in the final product therefore they can be characterized as xenobiotics. Due to their high diversity and their low concentration levels in foods, monitoring their presence and concentration levels is a analytical challenge in the field of food science. This challenge motivated the current research whose implementation was achieved through 2 supplementary sub-objectives: A. Development of new analytical methods for sample preparation and analyte determination in the field of analysis of xenobiotics in foods for infants and small children and animal feed. B. Monitoring of the presence and concentration levels of a wide range of xenobiotics in real samples of foods for infants and small children and animal feed. The implementation of the first objective involved the development of new methods based on the following features: simplicity (simple procedures without the use of complicated equipment), short (appropriate for the analysis of a large number of samples in a short period of time), cheap (low consumption of reagents per sample), sensitive (ability to detect and quantify concentration at the level of few μg/kg) and reliable as to meet the E.U. requirements regarding the uncertainty of the analytical measurements. Thus in the framework of the current thesis a wide range of analytical methods were developed and validated for the determination of the following xenobiotic compounds: 1. 25 high toxicity pesticides and their metabolites in baby food with GC-ECD and GC-NPD as a determination technique. 2. Pesticide residues of different classes and their metabolites in baby food with LC-MS/MS as a determination technique. 3. Pesticide residues of different classes and their metabolites in animal feed with GC-MS/MS and LC-MS/MS as a determination technique. 4. Pesticide residues of different classes and their metabolites in milk using GPC as a clean-up step and GC-MS/MS and LC-MS/MS as a determination technique. 5. Pesticide residues of different classes and their metabolites in products of animal origin with GC-MS/MS as a determination technique. 6. Plant hormones in various plant commodities with LC-MS/MS and LC-TOF as a determination technique. 7. Mycotoxins of different classes in animal feed with LC-MS/MS and LC-TOF as a determination technique. 8. Mycotoxins of different classes in milk with LC-MS/MS and LC-TOF as a determination technique. The developed methods were applied for the implementation of the second objective, through the determination of various xenobiotic compounds in animal feed and in a variety of commodities used in the nutrition of infants and young children. Thus the following samples were studied-analyzed: 1. Sixty one baby food samples were analyzed for the determination of pesticide residues. Only 2 samples were found positive for the presence of pesticides but in concentrations below the LOQ of the method. 2. Forty six (46) animal feed samples were analyzed for the determination of pesticide residues. Most of the samples were found positive for the presence of pesticides with the particularly intense the presence of ∑endosulfan. 3. Thirty four (34) milk samples were analyzed for the determination of pesticide residues. No pesticides residues were found at levels above the LOD of the method. 4. Twenty four (24) meat and liver samples were analyzed for the determination of pesticide residues. No pesticides residues were found at levels above the LOD of the method. 5. Forty three (43) samples from various plant commodities were analyzed for the determination of plant hormons. A small percentage of the samples were found positive for the presence of plant hormones. The plant hormones detected were 1-naphthylacetic acid 1-naphthylacetic acid, 2.4 D, chlormequat, 4-Chlorophenoxyacetic acid, thiadiazuron and 2iP. 6. Sixty six (66) animal feed samples were analyzed for the determination of mycotoxins. A significant percentage of the samples were found positive for the presence of mycotoxins. The mycotoxins detected were aflatoxin B1, B2 G2, ochratoxin Α and Τ-2 toxin. 7. Thirty three (33) milk samples were analyzed for the determination of mycotoxins. A significant percentage of the samples were found positive for the presence of mycotoxins. No mycotoxins were found at levels above the LOD of the method.

Η βιομηχανοποίηση της πρωτογενούς παραγωγής και η παραγωγή επεξεργασμένων τροφίμων που απευθύνονται σε βρέφη και παιδιά μικρής ηλικίας υλοποιήθηκε μέσω της ανάπτυξης πλήθους νέων τεχνολογιών, οι οποίες είχαν ως αρνητικό επακόλουθο την εισαγωγή τοξικών ουσιών στην τροφική αλυσίδα. Επειδή η παρουσία των ουσιών αυτών στα τελικά προς κατανάλωση προϊόντα δεν είναι αναμενόμενη υπό κανονικές συνθήκες, αυτές χαρακτηρίζονται ως ξενοβιοτικές. Η μεγάλη ποικιλομορφία, σε συνδυασμό με τα χαμηλά όρια συγκέντρωσής τους στα τρόφιμα, έχουν αναγάγει την παρακολούθηση των επιπέδων τους σε πρόκληση για τον τομέα της ανάλυσης τροφίμων και αποτελέσει έναυσμα για τη διενέργεια της διατριβής, η οποία περιλαμβάνει την επίτευξη των παρακάτω δυο επιμέρους συμπληρωματικών στόχων: Α. Ανάπτυξη νέων αναλυτικών μεθόδων επεξεργασίας δειγμάτων και προσδιορισμού αναλυτών για την ανίχνευση ξενοβιοτικών ουσιών σε τρόφιμα για βρέφη-παιδιά μικρής ηλικίας και ζωοτροφές. Β. Παρακολούθηση των επιπέδων των συγκεντρώσεων για ποικίλες κατηγορίες ξενοβιοτικών ουσιών σε εμπορικά δείγματα τροφίμων για βρέφη- παιδιά μικρής ηλικίας και ζωοτροφών. Η υλοποίηση του πρώτου στόχου αναφέρεται στην ανάπτυξη νέων μεθόδων οι οποίες είναι απλές (απλή διαδικασία εκχύλισης χωρίς πολύπλοκο εξοπλισμό), σύντομες (κατάλληλες για ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων σε μικρό χρονικό διάστημα), οικονομικές (μικρή κατανάλωση αναλωσίμων ανά δείγμα), πολυδύναμες (κατάλληλη για ανάλυση ξενοβιοτικών ουσιών διαφορετικών χημικών κατηγοριών), ευαίσθητες (δυνατότητα ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης σε επίπεδα συγκέντρωσης λίγων μg/kg) και προπάντων αξιόπιστες, ώστε να πληρούνται οι απαιτήσεις περί διαχείρισης της αβεβαιότητας των μετρήσεων που έχει θεσπίσει η Ε.Ε. Συγκεκριμένα, κατά την εκπόνηση της διατριβής αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν οι παρακάτω πολυδύναμες αναλυτικές μέθοδοι προσδιορισμού για: 1. 25 Φυτοπροστατευτικά προϊόντα υψηλής τοξικότητας και μεταβολιτών τους σε παιδικές τροφές με τις τεχνικές GC-ECD και GC-NPD. 2. Φυτοπροστατευτικών προϊόντα διαφόρων χημικών κατηγοριών μεταβολιτών τους σε παιδικές τροφές με την τεχνική LC-MS/MS. 3. Φυτοπροστατευτικών προϊόντων διαφόρων χημικών κατηγοριών μεταβολιτών τους σε ζωοτροφές με τις τεχνικές GC-MS/MS και LC-MS/MS. 4. Φυτοπροστατευτικών προϊόντων διαφόρων χημικών κατηγοριών μεταβολιτών τους σε γάλα με εφαρμογή της τεχνικής GPC για την απομάκρυνση του λίπους και προσδιορισμό των αναλυτών με την τεχνική GC-MS/MS. 5. Φυτοπροστατευτικών προϊόντων και διαφόρων χημικών κατηγοριών μεταβολιτών τους σε προϊόντα ζωικής προέλευσης με την τεχνική GC-MS/MS. 6. Φυτορμονών σε φυτικά προϊόντα με τις τεχνικές LC-MS/MS και LC-TOF. 7. Μυκοτοξινών σε ζωοτροφές με τις τεχνικές LC-MS/MS και LC-TOF. 8. Μυκοτοξινών στο γάλα με τις τεχνικές LC-MS/MS και LC-TOF. Στη συνέχεια, οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν χρησιμοποιήθηκαν για την υλοποίηση του δεύτερου στόχου μέσω του προσδιορισμού των επιπέδων των ξενοβιοτικών ουσιών σε δείγματα τροφίμων για βρέφη-παιδιά μικρής ηλικίας και ζωοτροφών. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν-αναλύθηκαν δείγματα: 1. Εξήντα ενός παιδικών τροφών, στις οποίες προσδιορίστηκαν υπολείμματα των φυτοπροστατευτικών προϊόντων. Από αυτά μόνο τα δυο βρέθηκαν θετικά ως προς την παρουσία υπολειμμάτων φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε συγκέντρωση όμως κάτω του LOQ της μεθόδου. 2. Εξήντα τέσσερα ζωοτροφές, στις οποίες προσδιορίστηκαν τα υπολείμματα των φυτοπροστατευτικών προϊόντων. Ένα σημαντικό ποσοστό από αυτά βρέθηκε θετικό στην παρουσία υπολειμμάτων φυτοπροστατευτικών προϊόντων, με ιδιαίτερα έντονη την παρουσία του endosulfan. 3. Τριάντα τέσσερα γάλατα, στα οποία προσδιορίστηκαν τα υπολείμματα των φυτοπροστατευτικών προϊόντων. Σε κανένα από αυτά δεν διαπιστώθηκε παρουσία φυτοπροστατευτικών προϊόντων πάνω από το LOQ της μεθόδου. 4. Είκοσι τέσσερα κρέατα και συκώτια, στα οποία προσδιορίστηκαν τα υπολείμματα των φυτοπροστατευτικών προϊόντων. Σε κανένα από αυτά δεν διαπιστώθηκε η παρουσία φυτοπροστατευτικών προϊόντων πάνω από τα όρια αναφοράς της μεθόδου. 5. Σαράντα τρία δείγματα διαφόρων φυτικών προϊόντων, στα οποία ανιχνεύτηκε η παρουσία υπολειμμάτων φυτορμονών. Ένα μικρό ποσοστό από αυτά βρέθηκε να περιέχει φυτορμόνες και συγκεκριμένα τα μόρια 1-ναφθαλενοξικό οξύ, 2.4-D, chlormequat, 4-χλωροφαινοξυ-οξικό οξύ, thiadiazuron και 2iP. 6. Εξήντα έξι ζωοτροφές, στις οποίες προσδιορίστηκαν μυκοτοξίνες. Ένα σημαντικό ποσοστό από αυτά βρέθηκε να περιέχει μυκοτοξίνες και συγκεκριμένα, τις αφλατοξίνες B1, B2 και G2, την ωχρατοξίνη Α και την τοξίνη Τ-2. 7. Τριάντα τρία γάλατα, στα οποία προσδιορίστηκαν μυκοτοξινές και μεταβολίτες τους. Σε κανένα από αυτά δεν ανιχνεύτηκε η παρουσία μυκοτοξινών πάνω από τα όρια αναφοράς της μεθόδου.