Generation of conditional by inversion Sox2 allele

Abstract

Το γονίδιο Sox2 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που περιέχει την περιοχή HMG-box, σαν δομική μονάδα πρόσδεσης στο DNA. Θεωρείται ένα από τα γονίδια-κλειδιά με πρωταγωνιστικό ρόλο στην ρύθμιση της πλειοδυναμίας της πρώιμης εμβρυικής ανάπτυξης και στο καθορισμό της κυτταρικής μοίρας στην διάρκεια της ανάπτυξης και της ομοιόστασης. Κατά την διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης, το γονίδιο Sox2 είναι απαραίτητο για την δημιουργία της επιβλάστης. Όμως ο ρόλος του στα βλαστικά κύτταρα δεν είναι ακόμη γνωστός. Σε αυτήν την μελέτη δημιουργήσαμε μια χειρουργική απαλοιφή της λειτουργίας του Sox2 στην επιβλάστη χρησιμοποιώντας ένα επαγόμενο με αναστροφή Sox2 αλλήλιο. για την μετάδοση της επαγωγής, η μέθοδος του επαγόμενου με αναστροφή αλληλίου για την κατασκευή επαγόμενων αλληλίων βασίζεται σε μια βελτιστοποιημένη αναστρεφόμενη κασέτα παγίδευσης γονιδίων (Conditional by Inversion - COIN). Η κασέτα COIN περιλαμβάνει ένα ζευγάρι βελτιστοποιημένα σήματα πολυαδενυλίωσης για 3΄ μάτισμα, αλλά εισάγεται στην μη μεταγραφόμενη αλυσίδα του DNA του γονιδίου-στόχου, με αποτέλεσμα να μην μεταβάλλεται η μεταγραφή του γονιδίου, παρά μόνο όταν αναστρέφεται η κασέτα από το ένζυμο ανασυνδυασμού CRE. Για την εφαρμογή της τεχνολογίας του COIN σε όλα τα γονίδια που εκφράζουν πρωτεΐνες, το στοιχείο COIN έχει κατασκευαστεί μέσα σε ένα τεχνιτό ιντρόνιο, επιτρέποντας την εισαγωγή της κασέτας μέσα σε ένα εξώνιο. Συνεπώς, θεωρητικά η μέθοδος COIN θα πρέπει να είναι εφαρμόσιμη και σε γονίδια που αποτελούνται από ένα εξώνιο. Για να ελέγξουμε αυτήν την ιδέα κατασκευάσαμε ένα αλλήλιο του γονιδίου Sox2. Το συγκεκριμένο γονίδιο που αποτελείται από ένα εξώνιο προσφέρει σχεδιαστικές προκλήσεις αφού ο εγγυής υποκινητής και η περιοχή κωδικοποίησης της πρωτεΐνης αποτελούν ένα CpG νησιδίο και γεφυρώνονται από ένα επικαλυπτόμενο μετάγραφο, Sox2ot, που περιλαμβάνει και το mmu-miR1897. Σε αυτήν την εργασία, αποδεικνύουμε ότι παρόλη την διατάραξη του CpG νησιδίου από το ιντρόνιο της κασέτας COIN, το Sox2COIN αλλήλιο είναι φαινοτυπικά ίδιο με το αντίστοιχο άγριου τύπου αλλήλιο, και επίσης δεν παρεμβαίνει στην έκφραση του Sox2ot και mmu-miR1897. Επιπλέον, το ανεστραμμένο COIN αλλήλιο του γονιδίου, Sox2INV είναι λειτουργικά ανενεργό, καθότι ομοζυγωτά ζώα εμφανίζουν τον ίδιο φαινότυπο όπως το Sox2ßgeo/ßgeo, ένα πολύ καλά χαρακτηρισμένο Sox2 ανενεργό αλλήλιο. Τέλος το πλεονέκτημα της πλήρους ενσωμάτωσης του γονιδίου-μάρτυρα eGFP στο αλλήλιο COIN αποδεικνύεται από το γεγονός του ότι η έκφραση του αντικατοπτρίζει την έκφραση του Sox2 γονιδίου. Η αναστροφή του Sox2COIN αλλήλιου στην επιβλάστη παράγει φυσιολογικά ετεροζυγωτά Sox2INV/+ ενήλικα ζώα και Sox2INV/+(Η) απλοανεπαρκή μεταλλαγμένα έμβρυα. Sox2INV/+ (Η) απλοανεπαρκή και επαγόμενα Sox2INV/mosaic έμβρυα παρουσιάζουν προβλήματα στην δημιουργία των κοιλιών κατά την ανάπτυξη της καρδιάς, υποφέρουν από βραδυκαρδία, από δυσμορφία του μυοκαρδίου και αιμορραγία και πεθαίνουν περίπου την εμβρυική ημέρα Ε11 (Ε11). Sox2INV/+(Η) απλοανεπαρκή και επαγόμενα Sox2INV/mosaic έμβρυα παρουσιάζουν υδροκεφαλισμό, επιτείνουσα και παρεκκλίνουσα μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας στα εμπροστορυνική περιοχή, χωρίς καμία επίδραση στην δημιουργία των κρανιακών νεύρων, παρά μόνο σε ανώμαλη εμπροστορυνική ανάπτυξη. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το Sox2 δρα ως ροοστάτης της μετατροπής κυττάρων με επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό χαρακτήρα κατά την ανάπτυξη της νευρικής ακρολοφίας.