Μελέτη του προσδιορισμού οργανομεταλλικών ενώσεων του σεληνίου σε βιολογικά υλικά και τρόφιμα με τεχνικές εκχύλισης και χρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας

Abstract

Since organoselenium species (selenoaminoacids, alkylselenides etc.) and also the inorganic species of selenites (Se(IV)) and selenates (Se(VI)) are known to be present in biological liquids and tissues. Determination of organoselenium species (inorganic and selenoaminoacids) by chromatographic techniques (gas or liquid chromatography) hyphenated by mass spectrometry in biological fluids or food was studied. Specific, in order to determined the selenites, two solid phase microextraction modes were investigated and compared for their performance in various biological liquids like human urine and saliva as well as various types of milk. Using sodium tetraethylborate as ethylating reagent, selenite are converted in situ to volatile diethylselenides. The derivative is collected in situ by solid phase microextraction using a silica fibre coated with poly-dimethylsiloxane either from the headspace or directly from the liquid phase and finally determined by capillary GC-MS. Under optimum conditions of SPME, the GC separation was also optimized. Between the two examined microextraction techniques, direct immersion of the PDMS fibre in the liquid phase was proved less satisfactory. A non-fat milk powder certified reference material was analyzed to evaluate the accuracy of the method. The overall precision of the method was ranged between 6.2% and 9.7%. Detection limits achieved were 0.05μgL−1 for human urine, 0.08 μg L−1 for saliva and 0.03–0.06 μg L−1 in various milk matrices.Also, two different derivatizing reagents (sodium tetraethylborate and sodium tetraphenylborate) were tested for the development of a fast and sensitive method for the determination of selenites in human urine.The procedure is based on in situ derivatization of selenites in aqueous medium. Selenite ions are converted to diethylselenide or diphenylselenide and subsequently collected from the headspace by solid phase microextraction. The optimization of the HS-SPME and GC conditions was performed both in aqueous and urinary solutions. Between the two alkylation’s reagents, tetraethylborate was proved more efficient and the quantitation was satisfactory. Aqueous certified reference materials were analyzed to evaluate the accuracy of the method. The precision of the method was 4.2 % and the calculated detection limit was 0.05 μg L−1 for human urine. Then, developed a method for determination of dimethyldiselenide after optimization of parameters HS-SPME and GC-MS. The method in aqueous solutions, without used derivatisation reagent, was applied. Even the recovery of dimethyldiselenide in variety of samples and substrates under optimal conditions without any pre-treatment were studied. The simultaneous determination of selenomethionine, selenoethionine, selenocystine, dimethyl-diselenide and diphenyldiselenide was investigated for the first time by a hyphenated HPLC-IT-TOF-MS technique using atmospheric pressure chemical ionization (APCI). The produced ions are trapped in an ion trapping cell and subsequently are ejected to a time-of-flight analyzer. Alkylselenides and the most common selenoaminoacids were successfully determined after optimization of the instrumental and procedural parameters of the above system in less than 10 min. Reversed phase HPLC-IT-TOF-MS was proved to be a powerful and high resolution technique with high sensitivity and many capabilities regarding organoselenium speciation.

ι ενώσεις του σεληνίου (σεληνοαμινοξέα, αλκυλοσεληνιούχες κ.λ.π.) καθώς επίσης και τα ανόργανα είδη κυρίως τα Se(IV), και λιγότερο τα Se(VI), διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο και μπορούν να ανιχνευτούν σε βιολογικά υγρά και ιστούς. Αρχικά αναπτύχθηκε μια μέθοδος για τον προσδιορισμό των σεληνιωδών ιόντων με SPME-GC/MS. Ερευνήθηκαν δύο διαφορετικοί τρόποι της SPME και συγκρίθηκαν τα χαρακτηριστικά επίδοσης τους σε ποικίλα υποστρώματα, όπως ανθρώπινα ούρα, σίελο και γάλα. Χρησιμοποιώντας τετρααιθυλοβορικό νάτριο ως αιθυλιωτικό αντιδραστήριο, τα σεληνιώδη μετατρέπονται in situ στην πτητική μορφή των διαιθυλοσεληνιούχων. Το παράγωγο συλλέγεται άμεσα με την τεχνική της μικροεκχύλισης στερεής φάσης χρησιμοποιώντας μια ίνα με επικάλυψη πολυδιμεθυλοσιλοξανίου είτε από υπερκείμενη φάση είτε απευθείας με εμβάπτιση από την υγρή φάση. Για τον ικανοποιητικό προσδιορισμό βελτιστοποιείται όλο το σύστημα SPME και GC. Μεταξύ των δύο τρόπων μικροεκχύλισης, η άμεση εμβάπτιση της ίνας PDMS αποδείχθηκε λιγότερο αποτελεσματική. Η ποσοτικοποίηση των σεληνιωδών ιόντων επιτεύχθηκε με επιλεκτική μέτρηση ιόντων στο ΜS με καλά χαρακτηριστικά επίδοσης. Ένα πιστοποιημένο υλικό αναφοράς ουσίας γάλακτος σε σκόνη χωρίς λιπαρά αναλύθηκε για να αξιολογηθεί η ακρίβεια της μεθόδου. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου κυμάνθηκε μεταξύ 6,2 % και 9,7 %. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθηκαν ήταν 0,05 μg L-1 για τα ανθρώπινα ούρα, 0,08 μg L-1 για το σίελο και 0,03-0,06 μg L-1 για τους διάφορους τύπους γάλακτος (με λιπαρά, χωρίς λιπαρά, φρέσκο παστεριωμένο γάλα). Εν συνεχεία δοκιμάστηκαν δύο διαφορετικά αντιδραστήρια παραγωγοποίησης (το τετρααιθυλοβορικό νάτριο και το τετραφαινυλοβορικό νάτριο) για την ανάπτυξη ταχείας και ευαίσθητης μεθόδου για τον προσδιορισμό των σεληνιωδών ιόντων στα ανθρώπινα ούρα. Τα σεληνιώδη ιόντα μετατρέπονται σε διαιθυλοσεληνιούχα ή διφαινυλοσεληνιούχα, συλλέγονται από την υπερκείμενη αέρια φάση της μικροεκχύλισης στερεής φάσης και προσδιορίζονται ποσοτικά με GC-MS. Για την ανάπτυξη της μεθόδου βελτιστοποιήθηκαν οι κρισιμότεροι παράμετροι της HS-SPME και του GC. Μεταξύ των δύο αντιδραστηρίων αλκυλίωσης το τετρααιθυλοβορικό νάτριο αποδείχθηκε πιο αποτελεσματικό και με ικανοποιητικότερα ποσοτικά χαρακτηριστικά. Πιστοποιημένα υδατικά δείγματα αναφοράς αναλύθηκαν με σκοπό να εκτιμηθεί η ακρίβεια της μεθόδου. Η ακρίβεια της μεθόδου ήταν 4,2 % και το υπολογιζόμενο όριο ανίχνευσης ήταν 0,05 μg L-1 για τα ανθρώπινα ούρα. Έπειτα αναπτύχθηκε μια μέθοδος προσδιορισμού των διμεθυλοδισεληνιούχων με βελτιστοποίηση των παραμέτρων ΗS-SPME και GC-MS. Η μέθοδος εφαρμόστηκε αρχικά σε υδατικά διαλύματα χωρίς να χρησιμοποιηθεί αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Εν συνεχεία μελετήθηκε η ανάκτηση των διμεθυλοδισεληνιούχων σε ποικίλα δείγματα και υποστρώματα. Ακόμη αναπτύχθηκε μια μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμός της σεληνομεθειονίνης, σεληνοεθιονίνης, σεληνοκυστίνης, διμεθυλοδισεληνιούχων και διφαινυλοδισεληνιούχων για πρώτη φορά με την τεχνική HPLC-IT-TOF-MS χρησιμοποιώντας χημικό ιοντισμό υπό ατμοσφαιρική πίεση (APCI). Προσδιορίστηκαν με επιτυχία οι παραπάνω ενώσεις μετά από βελτιστοποίηση των παραμέτρων του οργάνου και της διαδικασίας του συστήματος που ακολουθήθηκε, με αποτέλεσμα τον μορφοειδικό διαχωρισμό των ενώσεων του σεληνίου χωρίς έντονο θόρυβο και καλή βασική γραμμή σε λιγότερο από 10 min. Τα όρια ανίχνευσης των πέντε ειδών σεληνίου κυμαίνονται μεταξύ 13 – 59 μg L-1 και η σχετική τυπική απόκλιση μεταξύ 4,2 – 9,3 %. Η συγκεκριμένη έρευνα αποτελεί τον βασικό κορμό για την ανάπτυξη μεθόδου για τον μορφοειδικό προσδιορισμό των οργανομεταλλικών ενώσεων του σεληνίου.