Identification and characterization of genes involved in resistance to neonicotinoid insecticides in Drosophila melanogaster

Abstract

Insecticide resistance is a serious, long term problem that impacts agricultural production and health of animals and humans. Resistance to all major insecticide classes, including neonicotinoids, arose in numerous and diverse insect field populations. Imidacloprid, the most prominent neonicotinoid, has been widely used during the last decade in controlling different insect pests. Drosophila melanogaster, although not a pest species, is a widely used model organism and a promising model system for insecticide resistant research. In our study we have analyzed a Drosophila laboratory mutant which is resistant to Imidacloprid and cross-resistant to DDT. The mutant has been retrieved in a genome-wide Minos-based insertional mutagenesis screen. The resistant line was characterized using genetic, toxicological, molecular and transriptomic analysis. Genetic analysis mapped resistance to the right arm of the second chromosome. Toxicologal analysis showed higher activity of P450 enzymes, while molecular analysis revealed higher expression of three unlinked P450 genes in the resistant line compared to the susceptible line. Deep sequencing transcriptomic analysis showed changes in several groups of genes involved in metabolic processes. Taken together, these results strongly suggest that the mutation results in upregulation of several unlinked genes involved in metabolic detoxification of the insecticides. The exact molecular mechanism remains to be elucidated.

Η ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα αποτελεί ένα πολύ σημαντικό εμπόδιο για τον αποτελεσματικό έλεγχο εντόμων που είναι επιβλαβή στη γεωργία ή είναι φορείς ασθενειών. Ανθεκτικότητα σε όλες τις μεγάλες κατηγορίες εντομοκτόνων (οργανοφωσφορικά, καρβαμιδικά και πυρεθροειδή) έχει εμφανιστεί, σχετικά σύντομα μετά την εισαγωγή της χρήσης τους, σε πληθυσμούς πολλών ειδών εντόμων. Τα νεονικοτινοειδή αποτελούν μία από τις πλέον υποσχόμενες κατηγορίες εντομοκτόνων, με την Ιμιδακλοπρίδη ως το πιο επιτυχημένο μέλος της ομάδος, με τις μεγαλύτερες πωλήσεις παγκοσμίως. Τα νεονικοτινοειδή δρουν ως αγωνιστές των μετασυναπτικών νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης στο κεντρικό νευρικό σύστημα του εντόμου. Παρά το ότι τα νεονικοτινοειδή παραμένουν εξαιρετικά αποτελεσματικά, μελέτες πεδίου δείχνουν σημαντική αύξηση εμφάνισης ανθεκτικότητας σε διάφορα είδη επιβλαβών εντόμων. Η κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα είναι απαραίτητη για την περαιτέρω ανάπτυξη εργαλείων και παρεμβάσεων που μπορούν να βελτιώσουν τον έλεγχο των επιβλαβών εντόμων. Μέχρι τώρα έχουν χαρακτηριστεί δύο κύριοι μηχανισμοί οι οποίοι, μόνοι ή σε συνδυασμό, είναι υπεύθυνοι για την ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα: η ανθεκτικότητα στόχου και η μεταβολική ανθεκτικότητα. Η ανθεκτικότητα στόχου είναι αποτέλεσμα μεταλλαγών στο μόριο-στόχο του εντομοκτόνου. Μεταβολική ανθεκτικότητα προκαλείται συνήθως από την ενεργοποίηση ή την υπερέκφραση ενζύμων που εμπλέκονται στην αποτοξίνωση του εντομοκτόνου. Βιοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι η μεταβολική ανθεκτικότητα συνδέεται γενικά με τρεις οικογένειες ενζύμων: οξειδάσες μεικτής λειτουργίας (κυτοχρώματα Ρ450) καρβοξυλ-εστεράσες και S-τρανσφεράσες γλουταθειόνης (GST). Η μοριακή βάση της ανθεκτικότητας στόχου είναι αρκετά καλά μελετημένη και κατανοητή, αντίθετα οι βασικοί μοριακοί μηχανισμοί της μεταβολικής ανθεκτικότητας παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Ένα σημαντικό μέρος της γνώσης μας σχετικά με τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας προέρχεται από τη μελέτη φυσικών πληθυσμών που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα. Η επαγωγή ανθεκτικότητας σε εργαστηριακούς πληθυσμούς μέσω μεταλλαξιγένεσης αποτελεί μια εναλλακτική πειραματική προσέγγιση, η οποία έχει δώσει πρόσφατα σημαντικές πληροφορίες. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε μεταλλαξιγένεση μέσω του μεταθετού στοιχείου Minos για τη δημιουργία ανθεκτικών στελεχών σε έναν εργαστηριακό πληθυσμό του εντόμου-μοντέλου Drosophila melanogaster. Το μεταθετό στοιχείο (ΜΣ) Minos, μέλος της υπεροικογένειας Tc1/mariner, έχει χρησιμοποιηθεί για μεταλλαξιγένεση ή/και διαγένεση σε διάφορα είδη ευκαρυωτικών οργανισμών, και κυρίως στη Δροσόφιλα. Το γεγονός ότι τρανσποζόνια με βάση το Minos, μετά από κινητοποίηση μέσω της Minos τρανσποζάσης, παράγουν σταθερές ενθέσεις στα χρωματοσώματα με υψηλή απόδοση και με τελείως τυχαίο τρόπο έχει αναδείξει πρόσφατα την μεταλλαξιγένεση μέσω του στοιχείου αυτού ως ένα εξαιρετικά χρήσιμο εργαλείο γενετικής και γονιδιωματικής ανάλυσης. Η Δροσόφιλα, αν και δεν είναι επιβλαβές είδος, έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως πειραματικό μοντέλο στην έρευνα για την κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα. Μελέτες σε φυσικούς και εργαστηριακούς πληθυσμούς της D. melanogaster έχουν καταδείξει ότι το είδος αυτό μπορεί να αναπτύξει ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ φάσμα εντομοκτόνων. Κύριος στόχος της παρούσης μελέτης είναι η ταυτοποίηση γονιδίων της Δροσόφιλας που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα σε νεονικοτινοειδή εντομοκτόνα, με απώτερο στόχο την κατανόηση των σχετικών μοριακών μηχανισμών. Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων χωρίζεται σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος αφορά σειρά πειραμάτων τα οποία καταδεικνύουν την καταλληλότητα ενός αποδοτικού γενετικού συστήματος με βάση το ΜΣ για τη δημιουργία τυχαίων ενθέσεων οι οποίες ενεργοποιούν παρακείμενα γονίδια. Το σύστημα αυτό στηρίζεται στο τρανσποζόνιο Minos TREP, το οποίο περιέχει έναν χιμαιρικό υποκινητή που επάγεται in trans από τον μεταγραφικό ενεργοποιητή tTA. Στο δεύτερο μέρος παρουσιάζεται η τοξικολογική, βιοχημική, γονιδιωματική και γενετική ανάλυση ενός μεταλλαγμένου στελέχους ανθεκτικού στην Ιμιδακλοπρίδη και το DDT, το οποίο απομονώθηκε από μια σάρωση του γονιδιώματος της Δροσόφιλας με τη χρήση του TREP. Για την ανάπτυξη συστήματος σάρωσης του γονιδιώματος χρησιμοποιήθηκε το διαγονιδιακό στέλεχος TREP 2.30, το οποίο περιέχει μια ένθεση του τρανσποζονίου TREP στο χρωματόσωμο 4. Η ένθεση αυτή σε ομόζυγη κατάσταση δεν έχει φαινότυπο, αλλά είναι θανατογόνος σε ετερόζυγη κατάσταση, σε συνδυασμό με ένα διαγονιδιακό χρωματόσωμο που εκφράζει τον μεταγραφικό ενεργοποιητή tTA. Δεδομένου ότι το τρανσποζόνιο TREP είναι γενετικά σεσημασμένο με το γονίδιο-δείκτη white, είναι εύκολο να επιλεγούν έντομα στα οποία έχει συντελεστεί μετακίνηση του TREP από την αρχική του θέση στο γονιδίωμα σε άλλη θέση. Η συχνότητα της μετακίνησης του τρανσποζονίου TREP στους γαμέτες του στελέχους TREP 2.30, μετά από επαγωγή μέσω έκφρασης της Minos τρανσποζάσης, αποδείχτηκε εξαιρετικά υψηλή (92%) με τα 2/3 των νέων ενθέσεων να εντοπίζονται στα 3 μείζονα χρωματοσώματα (Χ, 2ο και 3ο). Για τον εντοπισμό γονιδίων που ενέχονται στην ανθεκτικότητα, διενεργήθηκε μεγάλης κλίμακας σάρωση του γονιδιώματος κατά την οποία παρήχθησαν περίπου 12900 νέες ενθέσεις TREP, που αντιστοιχούν σε στόχευση του 35% των γονιδίων της Δροσόφιλας. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι το σύστημα TREP 2.30 είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για μεγάλης κλίμακας γενετικές σαρώσεις του γονιδιώματος της Δροσόφιλας. Κατά τη διάρκεια της σάρωσης έγινε επιλογή ενός θηλυκού εντόμου με μεγάλη ανθεκτικότητα στην Ιμιδακλοπρίδη, από το οποίο μετά τις κατάλληλες διασταυρώσεις ιδρύθηκε ένα ανθεκτικό στέλεχος, το MIT[w-]3R2. Γενετική ανάλυση του χρωματοσώματος MIT[w-]3R2 έδειξε ότι ο χαρακτήρας της ανθεκτικότητας εντοπίζεται στο χρωματόσωμα 2, αλλά δεν έδειξε σύνδεση με το τρανσποζόνιο TREP, υποδηλώνοντας ότι η μεταλλαγή οφείλεται πιθανώς σε φαινόμενο "hit and run", δηλαδή ένθεση του τρανσποζονίου μετά την οποία έγινε εκτομή. Το στέλεχος MIT[w-]3R2 αναλύθηκε περαιτέρω με τη χρήση τοξικολογικών, βιοχημικών, γονιδιωματικών και γενετικών προσεγγίσεων. […]