Μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ ανθρώπινων καρδιακών κυττάρων και ομόλογων κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

The heart and the brain communicate with each other via α neural and α humoral route. The present study was undertaken in order to develop an in vitro system of primary co cultures of human adult cardiomyocytes (HACM) and homologous CNS cell cultures to be used as a model for the study of molecular mechanisms of humoral neurocardiac interactions. Firstly, an improved model of long term HACM culture will be developed, where the structural and functional properties of cultured cells will be studied. For single HACM cultures, cells were isolated from atrial specimens of 48 patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery. Cell viability, sarcomeric and cytoskeletal properties, intercellular junctional mediators and functionality expressed as protein secretion under steady-state conditions and in response to extracellular stimuli were monitored in HACM cultures for at least 8 weeks. Afterwards, co-cultures of HACM and CNS cells were performed indirectly, by culturing HACM with condioned medium (CM) from CNS mixed neuronal-astrocytic cultures developed from brain tissue specimens from 2 patients undergoing neurosurgical treatment for brain haematoma. Co-cultures were studied for up to 48 hours. In single HACM cultures absolute numbers of HACM decreased through the first 2 weeks with substantially lower rates of cell loss thereafter. Apoptosis predominated over necrosis as the principal mode of cell death affecting 4.1±1.6% of freshly dissociated cells that declined in culture (3.6±1.0% week 1, 1.3±0.5% week 2). HACM maintained rod-shaped morphology and cross-striated expression pattern of sarcomeric proteins β-myosin heavy chain and cytoskeletal desmin for the first 4 weeks. HACM expressed cardiac-specific adherence molecule Ν-cadherin throughout the culture duration indicating conserved contractile potential HACM remained functional early in culture, as indicated by BNP secretion, with maximal levels on 1st week that declined gradually by week 4. Cell responsiveness to metabolic stresses (serum deprivation) was detected, inducing an early (6 h) 1.8-fold increase in levels of BNP. In co-cultures of HACM and homologous CNS cells, apoptosis and necrosis rates of HACM were reduced. Apoptosis reduction reached a peak by 90 minutes after induction of co-culture (relative percentage reduction in co-cultures compared to HACM cultures-negative controls by -18.8±18.0%). Necrosis reduction reached a peak by 6 hours (relative percentage reduction by -27.3±17.6%). Conversely, after 6 hours (on 24 and 48 hours) CM showed no effect on apoptosis rates (24 hours, relative difference +42.3±32.0%), while necrosis reduction continued (24 hours relative reduction -19.1±50.9%). In conclusion, in the presented system of long term HACM culture, cells maintained morphological integrity, adult-type structural protein expression, cell-cell communication potential and functionality for 3-4 weeks in vitro, so that they can be utilized for the development of an in vitro cell model of humoral neurocardiac interactions. Co-culturing of HACM with homologous mixed neuronal-astrocytic CNS cell cultures indirectly deserves further evaluation as a possibly useful such model. Furthermore, the release of myocardial anti apoptotic and anti necrotic factors from CNS cells in vitro, suggested by the results of the present study, requires further investigation and confirmation.

Το καρδιαγγειακό σύστημα αλληλεπιδρά με το ΚΝΣ μέσω της νευρικής και της χυμικής οδού. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η δημιουργία ενός in vitro μοντέλου πρωτογενών συγκαλλιεργειών ανθρώπινων ενηλίκων μυοκαρδιακών (ΑΕΜΚ) και κυττάρων του ΚΝΣ, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των χυμικών μηχανισμών που διέπουν την νευρο-καρδιακή επικοινωνία. Για τη δημιουργία αυτού του μοντέλου θα προηγηθεί η βελτιστοποίηση και ο χαρακτηρισμός ενός συστήματος πρωτογενών καλλιεργειών κολπικών ΑΕΜΚ. Για τις καλλιέργειες ΑΕΜΚ, κολπικά ΑΕΜΚ απομονώθηκαν από ιστοτεμάχια ωτίου δεξιού κόλπου προερχόμενα από 48 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε καρδιοχειρουργική επέμβαση με χρήση εξωσωματικής κυκλοφορίας. Στις καλλιέργειες που ακολούθησαν μελετήθηκαν για τουλάχιστον 8 εβδομάδες in vitro: η βιωσιμότητα, η έκφραση σαρκομεριδιακών και κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, η έκφραση γονιδίων πρωτεϊνών των διακυττάριων συνδέσεων και η λειτουργικότητα των ΑΕΜΚ εκφραζόμενη από την ικανότητα να εκκρίνουν πρωτεΐνες στο εξωκυττάριο περιβάλλον, υπό σταθερές συνθήκες ή κατόπιν εφαρμογής εξωγενών ερεθισμάτων. Για το μοντέλο in vitro αλληλεπιδράσεων μεταξύ ΑΕΜΚ και κυττάρων του ΚΝΣ έγιναν έμμεσες συγκαλλιέργειες 6 ανεξάρτητων καλλιεργειών ΑΕΜΚ με μεικτές καλλιέργειες νευρώνων και αστροκυττάρων που απομονώθηκαν από εγκεφαλικό ιστό προερχόμενο από 2 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε νευροχειρουργική επέμβαση για εκκένωση εγκεφαλικού αιματώματος. Οι έμμεσες συγκαλλιέργειες έγιναν με καλλιέργεια των ΑΕΜΚ με μέσο τροποποιημένο από τις ομόλογες μεικτές καλλιέργειες κυττάρων ΚΝΣ επί συνολικά 48 ώρες. Ακολούθως μελετήθηκε ο ρυθμός της απόπτωσης και της νέκρωσης και η βιωσιμότητα των ΑΕΜΚ στα 90 λεπτά και τις 6, 24 και 48 ώρες μετά την έναρξη της συγκαλλιέργειας, προκειμένου να διερευνηθεί αν διαλυτοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα κύτταρα του ΚΝΣ επιδρούν στους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου των ΑΕΜΚ in vitro. Στις μονοκαλλιέργειες ΑΕΜΚ, ο απόλυτος αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων ελαττώθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια των 2 πρώτων εβδομάδων της καλλιέργειας ενώ στη συνέχεια ο ρυθμός κυτταρικής απώλειας ελαττώθηκε. Η απόπτωση επικρατούσε έναντι της νέκρωσης ως μηχανισμός κυτταρικού θανάτου σε όλη τη διάρκεια μελέτης των καλλιεργειών αφορώντας ποσοστό 4 1±1 6% των άμεσα απομονωθέντων από τον ιστό ΑΕΜΚ μειούμενο σε 3 6±1.0% την 1η εβδομάδα και 1.3±0.5% τη 2η εβδομάδα. Τα ΑΕΜΚ διατήρησαν το ραβδοειδές σχήμα τους και το υπό μορφή εγκάρσιων γραμμώσεων χωρικό πρότυπο έκφρασης της σαρκομεριδιακής πρωτεΐνης β-ισομορφής της βαρειάς αλυσίδας της μυοσίνης και της κυτταροσκελετικής δεσμίνης για έως 4 εβδομάδες. Επίσης, παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου της πρωτεΐνης των διακυττάριων συνδέσεων Ν-καντερίνης σε όλη τη χρονική διάρκεια των καλλιεργειών, υποδηλώνοντας τη διατήρηση συσταλτικού δυναμικού. Ως ένδειξη λειτουργικότητας των ΑΕΜΚ διαπιστώθηκε έκκριση της πρωτεΐνης BNP στο υπερκείμενο στα αρχικά στάδια της καλλιέργειας τα επίπεδα της οποίας έφθασαν σε μέγιστη τιμή κατά την 1η εβδομάδα ενώ μειώθηκαν σταδιακά μέχρι την 4η εβδομάδα. Επίσης τα ΑΕΜΚ ανταποκρίνονταν στην εφαρμογή εξωγενούς ερεθίσματος μεταβολικής φόρτισης (στέρηση ορού) αυξάνοντας ταχέως (στις 6 ώρες μετά το ερέθισμα) την έκκριση BNP κατά 1.8 φορές περισσότερο από τη βασική έκκριση. Στις συγκαλλιέργειες των ΑΕΜΚ με το τροποποιημένο μέσο των καλλιεργειών ομολόγων κυττάρων ΚΝΣ διαπιστώθηκε ελάττωση της απόπτωσης και της νέκρωσης και μικρή αύξηση του ποσοστού των βιώσιμων ΑΕΜΚ χωρίς ωστόσο στατιστική σημαντικότητα. Η μεγαλύτερη ελάττωση του ποσοστού των αποπτικών ΑΕΜΚ σημειώθηκε μετά από 90 λεπτά συγκαλλιέργειας (σχετική διάφορα ποσοστού αποπτωτικών ΑΕΜΚ μεταξύ συγκαλλιεργειών και καλλιεργειών αρνητικών μαρτύρων -18.8±18.0%). Η ελάττωση του ρυθμού νέκρωσης έφθασε σε μέγιστη τιμή στις 6 ώρες (σχετική διάφορα -27.3±17.6%). Αντίθετα, μετά από 6 ώρες έμμεσης συγκαλλιέργειας (24, 48 ώρες) η ευνοϊκή επίδραση του τροποποιημένου μέσου εξασθένησε όσον αφορά στη διαδικασία της απόπτωσης (24 ώρες σχετική διαφορά +42.3±32.0%) ενώ συνεχίσθηκε ως προς τη πρωτογενή νέκρωση (24 ώρες, σχετική ελάττωση κατά 19.1±50.9%). Συμπερασματικά, τα ΑΕΜΚ καλλιεργούμενα σύμφωνα με το περιγραφέν σύστημα διατηρούν σε ικανό βαθμό τα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του ενήλικου μυοκαρδίου για 4 εβδομάδες in vitro ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν αξιόπιστα για τη δημιουργία in vitro μοντέλου χυμικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του μυοκαρδίου και του ΚΝΣ. Οι έμμεσες συγκαλλιέργειες ΑΕΜΚ με ομόλογες μεικτές καλλιέργειες νευρώνων και αστροκυττάρων ΚΝΣ θα μπορούσαν να αξιολογηθούν περαιτέρω ως μοντέλο μελέτης των εν λόγω αλληλεπιδράσεων καθώς τα ΑΕΜΚ διατηρούν επαρκώς τη βιωσιμότητά τους σε αυτές. Επιπρόσθετα, ενδείξεις που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη υπέρ της ύπαρξης διαλυτών παραγόντων που εκκρίνονται από τα κύτταρα του ΚΝΣ και διαθέτουν αντι-αποπτωτική/αντι-νεκρωτική δράση επί των ΑΕΜΚ χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης.