Μελέτη του νευροειδικού μορίου BM88 του ποντικού: δομή του γονιδίου BM88/Cend1, προσδιορισμός του βασικού υποκινητή κα δημιουργίας ζωικού μοντέλου απαλοιφής - Knockout

Abstract

BM88 protein is an early marker of the neuronal lineage in the central nervous system. Its appearance coincides with the period of neuronal birth, while its expression promotes the differentiation of progenitor cells to a neuronal phenotype and remains high in differentiated neurons of the adult brain (Patsavoudi et al., 1989). In vitro experiments have shown that BM88 overexpression, in the neuroblastoma cell line Neuro2a, leads to exit from the cell cycle, while promoting the morphological and molecular differentiation of these cells to a neuronal phenotype (Georgopoulou et al., 2006; Mamalaki et al., 1995). BM88 pattern of expression in vivo in combination with its role in cell cycle arrest and differentiation, shown in vitro, support the view that BM88 participates in the process of progenitor cell differentiation to a neuronal fate. Due to its functional properties, NCBI database has established the name Cell Cycle Exit and Differentiation 1 (CEND1) for BM88 protein. Electron microscopy studies have shown that BM88 protein is localized in the limiting membranes of intracellular organelles such as mitochondria, the endoplasmic reticulum and synaptic vesicles, as well as in the plasma membrane (Patsavoudi et al., 1989). In order to better assess BM88 biology in vivo, the primary goal of the present thesis was the generation of a mouse BM88 knockout model. For this purpose, we first analyzed the structure of BM88 gene and specifically the location and function of its proximal promoter. Based on these results, we designed a targeting construct in order to ablate BM88 gene in a mouse model. We then proceeded in the phenotypic analysis of this model and in particular in the analysis of postnatal cerebellar development and the impact on motor behavior in the adult. Analysis of the BM88 gene structure, revealed that BM88 gene is ~3 kb long and is comprised of two exons and one intron. The first exon is alternatively spliced, without affecting the final protein product, in two alternative 5’ ends, 42 bp apart. The BM88 coding region is located in the second exon, while the 5’ untranslated region is interrupted by the intron. The functional significance of the presence of the two alternative transcripts does not seem to be related with the developmental stage of the animal. In fact, RT-PCR experiments on total RNA of mouse cerebella of different ages have not shown differences in the relative expression of these transcripts. The BM88 basic promoter was identified in luciferase reporter experiments, using deletion analysis in a series of plasmid constructs, generated by cloning different DNA fragments of the 5’ region of BM88 gene. It was thus shown that BM88 basic promoter is included in a 122 bp fragment, capable of inducing luciferase expression specifically in the neuroblastoma cell line Neuro2a and not in the non-neuronal cell line COS-7. It was also shown, that the transcription factor Pax6 increases the promoter activity of a fragment that contains a consensus binding site for this factor. In silico study of the promoter area, showed that it is contained within a CpG island and that it lacks TATA box, initiator element and downstream promoter element, which are the main characteristics of most common promoters (Papadodima et al., 2005). Indeed the BM88 gene has multiple start sites, as shown in SI nuclease mapping. Within the mouse promoter region there are also two Spi binding sites, similar to the human promoter, for which functionality and direct activation by Spi have been previously shown (Papadodima et al., 2005). For ablation of the BM88 gene in mouse, we used homologous recombination methodology, by which the entire BM88 coding region as well as the 3’ UTR were replaced with the β- galactosidase gene. BM88 knockout homozygous mice were found to be viable, fertile, with a normal life expectancy and with no overt abnormalities in nervous system development. In order to study the effects of BM88 ablation, we chose to analyze the cerebellum, which is a well characterized part of the brain, with a relatively simple cytoarchitecture and organization. BM88 is most prominently expressed by Purkinje cells, but also granule neurons, of the cerebellum in wild type mice. A similar pattern of expression was found for ß-galactosidase protein in BM88 knockout mice. Macroscopic analysis of the cerebella from BM88 knockout mice did not show any overt abnormalities in comparison with wild type mice, however a more detailed observation revealed important differences between genotypes. More specifically, examination of cerebellar layering showed an increase in the thickness of the external granule layer (EGL) with a concomitant decrease in the molecular layer as well as impaired differentiation of Purkinje cells, most notably exemplified by a significant decrease in their dendritic arborization. Several experimental approaches showed that the increased size of the EGL was due to increased proliferation of granule progenitor cells (GPCs) as well as delayed inward radial granule cell migration. Increased proliferation of GPCs was found to be accompanied by a significant increase in Cyclin D1 levels, which plays a fundamental role in cell cycle progression and regulation of Gl phase check point. Examination of different factors, which are known to participate in the molecular pathway regulating GPC proliferation and expansion upstream of Cyclin Dl, such as Sonic Hedgehog and its receptors Smoothend and Patched (Vaillant and Monard, 2009), revealed differences in their mRNA expression levels in BM88 knockout animals, as compared to wild type. These observations suggest a direct or indirect involvement of BM88 in the Shh/cyclin D1 pathway. In order to gain insight into the mechanism by which BM88 exerts its influence on granule cell migration, several aspects of this process were examined. First, observation of the Bergmann glia cell axons, onto which migrating granule cells are directly apposed to, by means of nestin immunofluoresence, did not show any differences between genotypes. Similarly, no differences were found in the expression levels of the transcription factor Pax6, which participates in granule cell migration (Engelkamp et al., 1999). This result is in agreement with Pax6 binding to BM88 promoter region, as shown in in vitro experiments, thus placing this transcription factor upstream of BM88 expression. On the other hand, there was a statistically important decrease in the mRNA expression levels of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF), which is secreted by granule cells to enhance their migration from the EGL to the IGL (Choi et al., 2005; Schwartz et al., 1997). In fact BDNF-/- mice show a similar phenotype, reflected in a delay in granule cell migration, as BM88 knockout animals (Schwartz et al., 1997). Increased granule cell proliferation and delayed migration do not seem to affect the differentiation program of these cells in BM88-/- mice. By contrast, Purkinje cell differentiation was severely impaired and BM88 null cerebella were shown to have obvious differences in the dendritic arborization of these cells, both during postnatal development and in the adult. Real Time PCR showed that Reelin mRNA levels were reduced almost by half in BM88 knockout animals, as compared to wild type. Reelin has been shown to regulate Purkinje cell organization into a monolayer and has additionally been implicated in the dendritic development of hippocampal neurons (Niu et al., 2004). Thus the observed reduction in Reelin is probably responsible for the impaired development of the Purkinje cell dendritic tree in BM88-/- mice. Since abnormal cerebellar layering and reduced dendritic Purkinje cell arborization have been shown to lead to motor coordination defects, BM88 null mice were subjected to a set of behavioral tests, such as footprint analysis and rotarod motor coordination test. In both cases, BM88 knockout mice, showed defects in motor performance when compared to wild type mice, which were reflected in ataxic gait and abnormalities in motor coordination. In conclusion, the experimental findings of the present thesis, suggest that BM88 is necessary for normal cerebellar development and demonstrate the important role of BM88 in regulating the balance between cell cycle exit and differentiation. Further, our results show that BM88 negatively regulates Cyclin D1 expression, thus promoting cell cycle exit and differentiation of precursor cells to a neuronal fate. Moreover, the present thesis reveals a new role for BM88 in cerebellar granule cell migration, a role that probably extends to other neuronal populations, such as neurons of the embryonic cortex and other brain areas, where BM88 is expressed. Deregulation of the expression of several molecules such as Shh, cyclin Dl, BDNF και reelin in BM88 knockout mice, also reveal a direct or indirect participation of BM88 in the respective signaling pathways. The exact mechanism by which BM88 participates in these signaling pathways is the objective of future investigations. Nevertheless, our results, in combination with the results from other research groups, show a tight cooperation between granule neurons and Purkinje cells, during cerebellar development. Interactions between these two cell types are required for the regulation of granule cell proliferation, the timing of their transition to postmitotic cells and the onset of their radial migration. On the other hand, as granule cells migrate through the molecular layer where Purkinje cell dendrites develop, they seem to regulate this process. BM88 protein is involved during this entire developmental process. Thus the proposed model by which BM88 exerts its function is summarized below. Cerebellar granule cells and Purkinje neurons are subject to a BM88-dependent genetic program which leads to their differentiation and maturation. In granule cells, this program starts with the expression of the transcription factor Mathl, which is responsible for the genesis and maintenance of this neuronal population, and continues with the expression of Pax6. The latter transcription factor can bind to BM88 promoter and induce BM88 expression in these cells, thus resulting in cyclin D1 dowregulation, exit from the cell cycle and initiation of their differentiation into mature granule neurons. At the same time BM88 expression in the endoplasmic reticulum and synaptic vesicles of posmitotic granule cells may regulate the secretion of reelin and BDNF, thus promoting granule cell migration as well as Purkinje cell differentiation. In Purkinje cells BM88 expression can affect their differentiation and dendritic arborization and on the other hand may regulate secretion or expression of specific factors responsible for GPCs proliferation and expansion, such as the potent mitogen. Investigations are under way for the assessment of direct interactions by which BM88 exerts its function. For this purpose several experimental approaches are in progress, such as DNA microarray as well as proteomic analysis of BM88 knockout in comparison to wild type cerebella. It should also be of interest to dissect BM88 function in other areas of the central and peripheral nervous system where BM88 is expressed, in order to gain further insight into their development and differentiation programs. Overall, the study of BM88 function will greatly contribute to our understanding of the main processes, such as proliferarion, cell cycle exit, migration and neuronal differentiation leading to the generation of the correct neuronal circuits in the adult nervous system.

Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι πρώιμος μάρτυρας της γενεαλογίας των νευρώνων στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Η εμφάνισή της συμπίπτει με τη γέννηση των νευρώνων, ενώ η έκφρασή της επάγει τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων σε νευρώνες και παραμένει σε υψηλά επίπεδα στους διαφοροποιημένους νευρώνες του ενήλικου εγκεφάλου (Patsavoudi et al., 1989). Πειράματα in vitro έδειξαν ότι η υπερέκφραση της ΒΜ88 στην κυτταρική σειρά του νευροβλαστώματος του ποντικού (Neuro 2a) προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο και τη μορφολογική και μοριακή διαφοροποίησή τους προς το νευρωνικό φαινότυπο (Georgopoulou et al., 2006; Mamalaki et al., 1995). Το πρότυπο έκφρασης της ΒΜ88 in vivo σε συνδυασμό με την αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή της διαφοροποίησης, όπως έχει μελετηθεί in vitro, υποστηρίζουν την άποψη ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συμμετέχει στη διαδικασία της διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων προς το νευρωνικό φαινότυπο. Για τα παραπάνω λειτουργικά της χαρακτηριστικά η βάση δεδομένων NCBI έχει καθιερώσει για τη ΒΜ88 την ονομασία Cell Cycle Exit and Differentiation 1 (CEND1), δηλαδή «έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση 1». Μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχουν δείξει ότι η ΒΜ88 εντοπίζεται στις μεμβράνες ενδοκυτταρικών οργανιδίων, όπως τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικό δίκτυο και τα συνοπτικά κυστίδια, αλλά και στην κυτταρική μεμβράνη (Patsavoudi et al., 1989). Για την καλύτερη κατανόηση της βιολογίας της πρωτεΐνης ΒΜ88 in vivo, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η δημιουργία μοντέλου απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88. Αρχικά μελετήθηκε η δομή του γονιδίου ΒΜ88 του ποντικού και συγκεκριμένα η δομή και λειτουργικότητα του βασικού υποκινητή του. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά σχεδιάστηκε κατάλληλη πλασμιδιακή κατασκευή για τη στόχευση και απαλοιφή της γενετικής περιοχής του ΒΜ88 σε μοντέλο ποντικού. Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι επιπτώσεις της απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88 στο φαινότυπο του knockout μοντέλου και συγκεκριμένα αναλύθηκε η ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας σε μεταγεννητικό στάδιο και η κινητική συμπεριφορά των ενήλικων ζώων. Η μελέτη της δομής του γονιδίου έδειξε ότι αυτό καλύπτει μια περιοχή ~3 kb και αποτελείται από δύο εξώνια και ένα εσώνιο. Το πρώτο εξώνιο υφίσταται εναλλακτική συρραφή μέσω δύο εναλλακτικών 5’ άκρων που απέχουν 42 bp. Η κωδική περιοχή βρίσκεται στο δεύτερο εξώνιο, ενώ η 5' μη μεταφραζόμενη περιοχή διακόπτεται από το εσώνιο. Η λειτουργική σημασία της ύπαρξης των δύο εναλλακτικών μεταγράφων δε φάνηκε να σχετίζεται με το αναπτυξιακό στάδιο του ζώου, όπως δείχθηκε σε πειράματα αντίστροφης μεταγραφής και PCR σε παρεγκεφαλίδες ποντικών διαφόρων ηλικιών. Η μελέτη του υποκινητή του γονιδίου ΒΜ88 έγινε με πειράματα παροδικής επιμόλυνσης κυτταρικών σειρών με μια σειρά πλασμιδιακών κατασκευών, στις οποίες είχαν κλωνοποιηθεί διάφορα τμήματα της 5’ μη μεταφραζόμενης περιοχής του γονιδίου πριν το γονίδιο της λουσιφεράσης. Έτσι διαπιστώθηκε ότι ο βασικός υποκινητής του γονιδίου ΒΜ88 περιέχεται σε τμήμα μήκους 122bp, το οποίο είναι ικανό να προάγει την έκφραση της λουσιφεράσης ειδικά στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος ποντικού Neuro2A και όχι στη μη νευρικής προέλευσης σειρά COS7. Μάλιστα, δείχθηκε, ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Pax6, αυξάνει την ενεργότητα τμήματος του υποκινητή στην 5’ περιοχή του γονιδίου ΒΜ88, που περιλαμβάνει ειδική θέση πρόσδεσης για τον παράγοντα αυτό. In silico μελέτη της αλληλουχίας της περιοχής του υποκινητή έδειξε, ότι περιέχεται σε νησίδα CpG και ότι δεν διαθέτει στοιχεία κοινού υποκινητή, όπως αλληλουχία TATA, αλληλουχία έναρξης και καθοδικό στοιχείο έναρξης (Papadodima et al., 2005). Πράγματι, σε ανάλυση με τη νουκλεάση S1, βρέθηκε ότι η έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 γίνεται από πολλαπλές εναλλακτικές θέσεις. Στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου ΒΜ88 του ποντικού, υπάρχουν ακόμα 2 θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Spi, όμοια με το γονίδιο ΒΜ88 του ανθρώπου, για το οποίο η λειτουργικότητα και η απευθείας ενεργοποίηση από τον παράγοντα Spi έχουν δειχθεί (Papadodima et al., 2005). Για την απαλοιφή του γονιδίου ΒΜ88 σε μοντέλο ποντικού χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του ομόλογου ανασυνδυασμού, ώστε η κωδική περιοχή του γονιδίου ΒΜ88, αλλά και η 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή, να αντικατασταθεί από το γονίδιο της β-γαλακτοζιδάσης. Τα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα γεννιούνται και μεγαλώνουν κανονικά, είναι γόνιμα και δεν εμφανίζουν σοβαρές ανωμαλίες στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Για τη μελέτη των συνεπειών της απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88 στο ζωικό αυτό μοντέλο, επιλέχθηκε η παρεγκεφαλίδα, καθώς αποτελεί μια καλά χαρακτηρισμένη περιοχή του εγκεφάλου με σαφή δομή και οργάνωση. Η έκφραση της ΒΜ88 στην παρεγκεφαλίδα εντοπίζεται στα κύτταρα Purkinje και στα κοκκιώδη κύτταρα. Αντίστοιχο πρότυπο έκφρασης παρατηρήθηκε για τη β-γαλακτοζιδάση στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα. Μακροσκοπική παρατήρηση της παρεγκεφαλίδας ομόζυγων ποντικών δεν έδειξε σημαντικές ανωμαλίες της περιοχής αυτής του εγκεφάλου σε σύγκριση με τα ζώα φυσικού τύπου. Ωστόσο, λεπτομερέστερη εξέταση των διαφόρων στιβάδων του φλοιού της παρεγκεφαλίδας, έδειξε ότι, η εξωτερική κοκκιώδης στιβάδα (EGL) είναι παχύτερη στα ΒΜ88-/- ομόζυγα ζώα. Με μια σειρά πειραμάτων βρέθηκε, ότι η αύξηση αυτή οφείλεται αφενός σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των πρόδρομων κοκκιωδών κυττάρων και αφετέρου σε καθυστερημένη μετανάστευση προς την εσωτερική κοκκιώδη στιβάδα. Παράλληλα βρέθηκε μειωμένη διαφοροποίηση των κυττάρων Purkinje της παρεγκεφαλίδας τόσο κατά την πρώιμη μεταγεννητική περίοδο, όσο και στα ενήλικα ζώα. Η αύξηση στον πολλαπλασιασμό φάνηκε να συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων της κυκλίνης D1, που ρυθμίζει τη μετάβαση από το σημείο ελέγχου της φάσης Gl του κυτταρικού κύκλου και συνδέεται με την απόφαση του κυττάρου να συνεχίσει να πολλαπλασιάζεται ή να οδηγηθεί σε μεταμιτωτική φάση. Έλεγχος παραγόντων, του σηματοδοτικού μονοπατιού που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κοκκιωδών κυττάρων και οι οποίοι δρουν πριν την κυκλίνη D1, όπως ο παράγοντας Shh και οι υποδοχείς του Smoothened και Patched (Vaillant and Monard, 2009), σε πειράματα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA των μορίων αυτών μεταβάλλονται στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα. Οι αλλαγές αυτές πιθανώς συνδέονται με τον ελαττωματικό πολλαπλασιασμό των κοκκιωδών κυττάρων και υποδεικνύουν την άμεση ή έμμεση συσχέτιση της ΒΜ88 με το μονοπάτι σηματοδότησης του Shh και της κυκλίνης D1. Για τη διερεύνηση των αιτίων της καθυστερημένης μετανάστευσης των κοκκιωδών κυττάρων, ελέγχθηκαν διάφοροι παράγοντες που συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή. Έτσι, παρατήρηση των κυττάρων της γλοίας Bergmann, κατά μήκος των οποίων γίνεται η ακτινωτή μετανάστευση των κοκκιωδών κυττάρων, με ανοσοϊστοχημική χρώση με το μάρτυρα nestin, δεν έδειξε διαφορές στην περίπτωση των ΒΜ88 knockout ομόζυγων ποντικών σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Pax6, ο οποίος έχει δειχθεί ότι συμμετέχει στη διαδικασία της μετανάστευσης των κυττάρων αυτών (Engelkamp et al., 1999), αποτέλεσμα που ήταν αναμενόμενο καθότι η μεταγραφή του γονιδίου ΒΜ88, φάνηκε να ρυθμίζεται από τον παράγοντα Pax6 και άρα βρίσκεται καθοδικά αυτού. Αντίθετα παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα mRNA για το νευροτροφικό παράγοντα BDNF, ο οποίος εκκρίνεται από τα διαφοροποιημένα κοκκιώδη κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κοκκιωδών κυττάρων (Choi et al., 2005; Schwartz et al., 1997). Μάλιστα, ομόζυγα -/- ζώα για τον παράγοντα αυτό, παρουσιάζουν αντίστοιχη ανωμαλία στη μετανάστευση (Schwartz et al., 1997), με τα ΒΜ88 -/- ομόζυγα ζώα. Ο αυξημένος πολλαπλασιασμός και η καθυστέρηση στη μετανάστευση δεν φάνηκαν να επηρεάζουν το πρόγραμμα διαφοροποίησης των κοκκιωδών κυττάρων. Εντούτοις παρατηρήθηκαν ανωμαλίες στη διαφοροποίηση των κυττάρων Purkinje και διαπιστώθηκε σαφής μείωση στην ανάπτυξη του δενδριτικού τους πλέγματος στα ΒΜ88-/- ομόζυγα σε σύγκριση με τα ζώα φυσικού τύπου. Πειράματα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, με εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο της reelin, που έχει δειχθεί ότι συμμετέχει στην ανάπτυξη των δενδριτών των νευρώνων του ιπποκάμπου (Niu et al., 2004), έδειξαν στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων mRNA στα ομόζυγα ΒΜ88-/- σε σύγκριση με τα ζώα φυσικού τύπου. Καθώς η ανώμαλη στιβάδωση του φλοιού της παραγκεφαλίδας αλλά και οι μορφολογικές ανωμαλίες στην ανάπτυξη του δενδριτικού πλέγματος των κυττάρων Purkinje, έχουν συσχετιστεί με προβλήματα κινητικής ισορροπίας, συντονισμού κινήσεων και κινητικής μάθησης, χρησιμοποιήθηκαν δυο δοκιμασίες ελέγχου των λειτουργιών αυτών στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα. Έτσι ελέγχθηκε αφενός η βάδιση και αφετέρου ο συντονισμός κινήσεων/ισορροπίας των ποντικών αυτών στη δοκιμασία της περιστρεφόμενης ράβδου. Και στις δυο δοκιμασίες, διαπιστώθηκε ότι τα ΒΜ88-/- ομόζυγα ζώα παρουσιάζουν μειωμένη κινητική ικανότητα, που αντικατοπτρίζεται σε αταξία στη βάδιση και έλλειψη συντονισμού στην κίνηση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι η ΒΜ88 είναι απαραίτητη για την ορθή ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας και επιβεβαιώνουν τον ρόλο της πρωτεΐνης ΒΜ88 στη ρύθμιση της λεπτής ισορροπίας μεταξύ προόδου του κυτταρικού κύκλου και διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων. Πράγματι, διαπιστώθηκε ότι η ΒΜ88 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση της κυκλίνης D1, οδηγώντας τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα σε διαφοροποίηση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα, φανερώνουν ένα νέο ρόλο για την πρωτεΐνη ΒΜ88 στη μετανάστευση των κοκκιωδών κυττάρων της παρεγκεφαλίδας, που πιθανώς ισχύει και για άλλες ομάδες νευρώνων του εγκεφάλου, όπως αυτών του εμβρυϊκού φλοιού, στους οποίους εκφράζεται η ΒΜ88. Οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, που εμπλέκονται στα μονοπάτια σηματοδότησης Shh/κυκλίνης Dl, BDNF και reelin στα ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα, δείχνουν την άμεση ή έμμεση επίδραση της ΒΜ88 στα μονοπάτια αυτά. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο δρά η ΒΜ88 στα παραπάνω μονοπάτια σηματοδότησης, αποτελεί αντικείμενο μελλοντικών μελετών. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της διεθνούς βιβλιογραφίας, δείχνουν ότι υπάρχει στενή συνεργασία μεταξύ κοκκιωδών νευρώνων και κυττάρων Purkinje κατά την ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας. Αμφίδρομες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αυτών τύπων κυττάρων είναι απαραίτητες για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κοκκιωδών κυττάρων και τη σηματοδότηση του χρόνου κατά τον οποίο θα γίνουν μεταμιτωτικά και θα ξεκινήσουν τη μετανάστευσή τους. Από την άλλη πλευρά, καθώς τα κοκκιώδη κύτταρα μεταναστεύουν δια μέσου της περιοχής όπου αναπτύσσουν το δενδριτικό πλέγμα τους τα κύτταρα Purkinje, φαίνεται ότι επηρεάζουν και ελέγχουν τη διαδικασία αυτή. Η πρωτεΐνη ΒΜ88 εμπλέκεται σε όλη τη διάρκεια των αναπτυξιακών αυτών διαδικασιών. Το μοντέλο που προτείνουμε για τη δράση της συνοψίζεται ως εξής. Τα πρόδρομα κοκκιώδη κύτταρα της παρεγκεφαλίδας, ακολουθούν ένα τέτοιο πρόγραμμα έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων και άλλων μορίων, που έχει σαν αποτέλεσμα την τελική ωρίμανση και διαφοροποίησή τους. Το πρόγραμμα αυτό ξεκινά με την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Mathl, που είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη των κοκκιωδών κυττάρων από τα αρχικά στάδια της γέννησής τους, και συνεχίζεται με την έκφραση του παράγοντα Pax6. Ο τελευταίος μπορεί να προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου ΒΜ88 και να επάγει την έκφρασή του στα κύτταρα αυτά, με αποτέλεσμα να σηματοδοτείται η μείωση των επιπέδων της κυκλίνης D1, η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο και η διαφοροποίηση προς ώριμα κοκκιώδη κύτταρα. Παράλληλα, η έκφραση της ΒΜ88 στο ενδοπλασματικό δίκτυο και τα συναπτικά κυστίδια των μεταμιτωτικών κοκκιωδών κυττάρων, είναι πιθανό να επάγει την έκκριση των πρωτεϊνών reelin και BDNF, προάγοντας έτσι, τόσο τη μετανάστευση των κυττάρων αυτών, όσο και τη διαφοροποίηση των κυττάρων Purkinje. Αντίστοιχα, η έκφραση της ΒΜ88 στα κύτταρα Purkinje, μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση ή και έκκριση παραγόντων, που είναι απαραίτητοι για τον πολλαπλασιασμό των κοκκιωδών κυττάρων, όπως είναι το μιτογόνο Shh. Για την περαιτέρω διαλεύκανση του μονοπατιού στο οποίο συμμετέχει η ΒΜ88, βρίσκονται σε εξέλιξη πειράματα ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης (DNA microarrays) αλλά και του πρωτεόματος του ιστού της παρεγκεφαλίδας από ΒΜ88 knockout ομόζυγα ζώα και από ζώα φυσικού τύπου. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης η ανάλυση και άλλων περιοχών του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, στις οποίες εκφράζεται η ΒΜ88, προκειμένου να δειχθούν πιθανές συνέπειες της απαλοιφής του γονιδίου ΒΜ88. Συμπερασματικά, η μελέτη της λειτουργίας της πρωτεΐνης ΒΜ88 αποτελεί καθοριστική συμβολή στην κατανόηση των κύριων κυτταρικών διεργασιών, όπως ο πολλαπλασιασμός, η έξοδος από τον κυτταρικό κύκλο, η μετανάστευση και η νευρωνική διαφοροποίηση, οι οποίες οδηγούν στη δημιουργία των σωστών νευρικών δικτύων στο ενήλικο ζώο.