Διερεύνηση του ρόλου των πρωτεϊνών Fras1/Frem εκτός της βασικής μεμβράνης των επιθηλίων

Abstract

The Fras1/Frem gene family encodes for structurally similar proteins of the extracellular matrix, functionally correlated with embryonic dermal-epidermal adhesion as deduced from the appearance of sub-epidermal blisters in mouse mutants compromising the function of Fras1, Frem1 and Frem2 proteins. Throughout the wider examination of the role of Fras1/Frem proteins, we began exploring areas of possible function of these proteins, other than the epithelial basement membrane. While all Fras1/Frem proteins are co-localized in all embryonic epithelial basement membranes, Frem3 is the only member of the family which shows a differential localization pattern, being detected on blood vessels and peripheral nerves, surrounding blood cells in embryos and being present in all adult epithelial basement membranes. Towards the understanding of the biological role of Frem3, we accomplished the targeted inactivation of the Frem3 gene in the mouse, in co-operation with Dr Kamal Chowdhury (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, Germany). One of the first observations is that crosses between Frem3+/- mice do not result in living homozygous animals, from the embryonic day E4.5 onwards. Since E4.5 defines the point when the embryo is implanted in the uterine wall, it is possible that the homozygous mutants die at the blastocyst stage. Analysis of the heterozygous mice revealed a plethora of phenotypic features such as characteristics of ichthyosis, dermatitis, alopecia, orchitis and epididymitis. The latter have also resulted in sterility of a very high proportion of the Frem3+/- male mice. The aforementioned phenotypic characteristics are indicative of a general mechanism of autoimmunity. Future experiments will have to disclose the exact role of the machinery leading to autoimmunity as well as how the partial shortage of Frem3 may contribute to all that. Regarding Fras1, previous mRNA in situ experiments, carried out on adult mouse brain sections, revealed that Fras1 is expressed by areas of the brain which play an important role in processes such as the memory of emotional reactions. Fear conditioning experiments on adult Fras1-/- mice suggest that these mice do not have any memory of the fear, whilst at the same time immunohistochemical experiments using various markers, revealed disturbances on the number of glial cells.

Στα ευρύτερα πλαίσια της λειτουργικής μελέτης των πρωτεϊνών Fras1/Frem, αναζητήσαμε περιοχές πιθανούς λειτουργίας τους, διαφορετικές από την βασική μεμβράνη των επιθηλίων. Η πρωτεΐνη Frem3 είναι η μοναδική από τις πρωτεΐνες της οικογένειας που αφενός μεν συνεντοπίζεται και συμπεριφέρεται όπως τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας, αφετέρου δε παρουσιάζει και διαφορετικό πρότυπο εντοπισμού. Συγκεκριμένα, περιβάλλει τα εμβρυικά επιθήλια όπως οι υπόλοιπες πρωτεΐνες της οικογένειας, και επιπλέον, εντοπίζεται σε όλα τα αιμοφόρα αγγεία, περιφερικά νεύρα και κύτταρα του αίματος και στη βασική μεμβράνη όλων των επιθηλίων στα ενήλικα άτομα. Με στόχο την κατανόηση της βιολογικής λειτουργίας της Frem3, πραγματοποιήθηκε η στοχευμένη απενεργοποίηση του γονιδίου Frem3 στον ποντικό με τη μέθοδο του ομόλογου ανασυνδυασμού σε συνεργασία με τον Dr. Kamal Chowdhury (Max Planck Institute, Goettingen, Γερμανία). Από διασταυρώσεις μεταξύ ετεροζυγωτών δεν έχουν εντοπιστεί ζώντα ομόζυγα άτομα από την εμβρυική ημέρα 4.5 (Ε4.5) και αργότερα. Η Ε4.5 οριοθετεί το στάδιο της εμφύτευσης του εμβρύου στη μήτρα και είναι πιθανόν τα Frem3-/- έμβρυα να πεθαίνουν στο στάδιο της βλαστοκύστης. Η μελέτη και ανάλυση των μεταλλαγμένων ετεροζυγωτών ποντικών παρουσιάζει μια πληθώρα συμπτωμάτων όπως, φαινοτυπικά χαρακτηριστικά αλωπεκίας, ιχθύωσης, δερματίτιδας, ορχίτιδας και επιδιδυμίτιδας και κατά συνέπεια στειρότητα στα αρσενικά. Τα φαινοτυπικά αυτά χαρακτηριστικά είναι ενδεικτικά για ένα γενικό μηχανισμό αυτοανοσίας, για την επιβεβαίωση του οποίου θα πρέπει να διεξαχθούν συγκεκριμένα πειράματα, με στόχο την ακριβή ταυτοποίηση των μηχανισμών μέσω των οποίων η μερική έλλειψη της Frem3 συμβάλλει στις παραπάνω διαταραχές. Όσον αφορά την πρωτεΐνη Fras1, το έναυσμα για την εκτενέστερη μελέτη της, αποτέλεσαν πειράματα mRNA in situ σε εγκεφάλους ενηλίκων ποντικών, απ’ όπου αναδείχθηκε η έκφραση του Fras1 σε συγκεκριμένες περιοχές που σχετίζονται με μαθησιακές διεργασίες, παρόλο που, μέχρι τώρα έχει σταθεί αδύνατο να εντοπιστεί η πρωτεΐνη σε εγκεφάλους. Πειράματα συμπεριφοράς στα μεταλλαγμένα Fras1-/- ποντίκια απέδειξαν ότι τα ποντίκια αυτά έχουν ελλιπή μνήμη του φόβου, ενώ ανοσοϊστοχημική ανάλυση με τη χρήση διαφόρων δεικτών δείχνει διαταραχές στον αριθμό γλοιακών κυττάρων.