Διερεύνηση της μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση ηλεκτροχημικών DNA βιοαισθητήρων και με θερμική αποδιάταξη

Abstract

Introduction of the methyl group at C-5 of cytosine in DNA is an inherited epigenetic modification which regulates RNA expression. It is critical for stem cell reprogramming and carcinogenesis and drastically affects the DNA conformation and thermal stability. The detection of DNA methylation by a simple, fast and inexpensive approach can simplify studies concerning genome-wide methylation. Electrochemical techniques, which comply with the above requirements, have been widely used for the study of electroactive biomolecules, such as DNA. In the present study, electrochemical techniques were applied for the direct detection of DNA structural changes in abnormal conditions (i.e. cancer), as a result of cytosine methylation, in comparison with fluorescent techniques. These studies were applied in natural DNA, avoiding chemical and enzymatic modification and in cancerous DNA of various degrees of methylation. Voltammograms were obtained using three different techniques, Alternating Current (AC), Square Wave (SW) and Differential Pulse (DP) Voltammetry and DNAs of different molecular weight and of varying degrees of methylation. It is evident from the results that, as expected, introduction of methylation cause the formation of a more compact, rigid DNA conformation regardless of molecular weight. In conclusion, voltammetry can constitute an inexpensive and useful tool for the investigation of DNA methylation and combined with fluorimetric analysis of thermal denaturation can provide useful information about DNA helical conformation. Fluorimetric analysis of the thermal denaturation of MSP products can also provide evidence of the site-specific methylation state.

Η εισαγωγή της μεθυλίωσης στις κυτοσίνες στην 5΄ θέση είναι μία από τις επιγενετικές τροποποιήσεις που μπορεί να υποστεί το μόριο του DNA. Πρόκειται για μία κρίσιμη διαδικασία που επιδρά σε διάφορους βιολογικούς μηχανισμούς, όπως ο επαναπρογραμματισμός των βλαστοκυττάρων και η καρκινογένεση. Η μεθυλίωση της κυτοσίνης επηρεάζει επίσης δραματικά τη διαμόρφωση και τη θερμική σταθερότητα του DNA. Η χημική αυτή μετατροπή, δε μεταβάλλει την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του μορίου. Το πρότυπο της, όπως είναι πλέον γνωστό, κληρονομείται, με συνέπεια μεταβολές στο μηχανισμό ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων. Η ανίχνευση της μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση μιας απλής, γρήγορης και οικονομικής διαδικασίας μπορεί να απλοποιήσει κατά πολύ μελέτες που αφορούν στη διερεύνηση της συνολικής μεθυλίωσης στο γονιδίωμα. Τέτοιου είδους τεχνικές είναι και οι ηλεκτροχημικές, οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για τη μελέτη ηλεκτροδραστικών βιομορίων, όπως το DNA. Στην παρούσα μελέτη εφαρμόστηκαν, για πρώτη φορά, ηλεκτροχημικές τεχνικές για την άμεση διερεύνηση των μεταβολών που προκύπτουν στη δομή του DNA σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις (πχ. καρκίνου), ως αποτέλεσμα της μεθυλίωσης της κυτοσίνης και σε σύγκριση με φθορισμομετρικές τεχνικές. Οι μελέτες αυτές εφαρμόστηκαν σε φυσικό DNA χωρίς τη μεσολάβηση χημικής ή ενζυμικής τροποποίησης και σε καρκινικό DNA διαφόρου βαθμού μεθυλίωσης. Tα βολταμμογραφήματα με τρεις διαφορετικές τεχνικές, ΑCV, SWV και DPV στα υπό μελέτη συστήματα DNA διαφορετικού μοριακού βάρους και βαθμού μεθυλίωσης απέδειξαν, ότι η εισαγωγή μεθυλίωσης στο μόριο του DNA, οποιουδήποτε μεγέθους, προκαλεί το σχηματισμό συμπαγούς, άκαμπτης δομής. Συμπερασματικά, η τεχνική της βολταμμετρίας μπορεί να αποτελέσει ένα οικονομικό και χρήσιμο εργαλείο για τη διερεύνηση της μεθυλίωσης στο DNA και σε συνδυασμό με τη φθορισμομετρική ανάλυση της θερμικής αποδιάταξης, μπορεί να παράγει χρήσιμες πληροφορίες για τη δομή της έλικας του DNA.