Έκφραση και ρόλος των πρωτεογλυκανών neurocan και phosphacan κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου

Abstract

Neurocan, a chondroitin sulfate proteoglycan, interacts with other molecules ofthe extracellular matrix and the cell surface and participates in signallingpathways. Phosphacan is a chondroitin/keratan sulfate proteoglycan that hasbeen studied extensively in the late embryonic and postnatal brain and in thespinal cord. Relatively little is known about the neurocan tissue-specificdistribution or function during the development of the embryo. We studied theneurocan and phosphacan spatio-temporal expression pattern by RT-PCR andimmunofluorescene in the early chick embryo from the morula stage (stage XI) toearly organogenesis (stage HH17, 29 somites). We also studied the role ofneurocan and phosphacan by using blocking antibodies directed againstneurocan or phosphacan in a set of functional studies.Neurocan mRNA was first detectable at the late gastrula stage (HH4) andits expression was developmentally regulated. Neurocan protein was firstdetectable in cells of the inchoate neural plate and in the extracellular matrix inembryos at stage HH4. At stage HH13 (19 somites), neurocan fluorescence wasintense in the myelencephalon, notochord, neural crest cells, the foregut lowerwall, pharyngeal arches, dorsal mesocardium, myocardium and in theendocardium. At stage HH17 (29 somites), neurocan expression was intense inthe telencephalon, myelecenphalon, diencephalon and in the neural tube.Expression of neurocan was strong in the retina, lens and intense in the corneain the eye, intense in the myocardium and lower in endocardium in the heart. In aset of functional studies using monoclonal antibodies directed against neurocan,the inhibition of neurocan function resulted in neural plate duplications, theneurepithelial cells exhibited mesenchymal characteristics and the somite, heartand gut formation were inhibited. The observed neural plate duplications point toan important role of neurocan to modulate the activity and availability of growthfactor(s) during the induction of neurectoderm.Phosphacan mRNA was first detectable at the morula stage (XI) and itcontinued to be expressed during development. At the blastula stage (XIII)phosphacan immunofluorescence was strong in the epiblast and hypoblast. At the gastrula stage (HH3-ΗΗ4), immunofluorescence was strong in the cellsaround and also ingressing through the streak and in mesenchymal cells. Atstage HH8 (4 somites), immunofluorescence was intense in the elevated neuralplate, especially in its dorsal surface. This implies a role for phosphacan in thefusion of neural folds medially during the formation of the neural tube. At stageHH11 (13 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the neuraltube, somites, gut lower wall and in the myocardium, endocardium and dorsalmesocardium in the heart and intense in the blood islands. By stage HH17 (29somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the myelencephalonand diencephalon, in the lens and retina in the eye, the neural crest cells, themyotome but not the dermatome and sclerotome in somites, the myocardium andendocardium in the heart and the dorsal aorta. Inhibition of function ofphosphacan by blocking antibodies showed that phosphacan participates in thefusion of neural folds to form the neural tube, in the opticoele determination toform the retina and in somite, heart and gut morphogenesis.

H neurocan και η phosphacan είναι πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης.Η neurocan θεωρείτο οτι είναι μια πρωτεογλυκάνη αποκλειστικά του εγκεφάλου.Η phosphacan έχει μελετηθεί σε προχωρημένα στάδια ανάπτυξης εμβρύωνποντικού και αρουραίου. Δεν ήταν γνωστό πότε αρχίζουν να εκφράζονται καιπως κατανέμονται χωρο-χρονικά οι neurocan και phosphacan καθώς το έμβρυοαρχίζει την ανάπτυξή του. Μελετήσαμε την έκφραση της neurocan και τηςphosphacan με RΤ-PCR και ανοσοφθορισμό στο έμβρυο όρνιθας από το στάδιοΧ (μορίδιο) έως το στάδιο HH17 (29 σωμίτες/πρώιμη οργανογένεση). Επίσηςμελετήσαμε το ρόλο της neurocan και phosphacan με τη χρήση μονοκλωνικώναντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου.Το mRNA της neurocan πρωτοανιχνεύτηκε στο στάδιο του προχωρη-μένου γαστριδίου (HH4) και η έκφραση του ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Ταπειράματα μας του ανοσοφθορισμού επίσης έδειξαν ότι η neurocan άρχισε ναανιχνεύεται στη νευρική πλάκα και στην εξωκυττάρια ουσία στο στάδιο τουπροχωρημένου γαστριδίου (HH4). Στα έμβρυα στο στάδιο των 19 σωμιτών(ΗΗ13), ο φθορισμός ήταν έντονος στον μυελεγκέφαλο, τη νωτοχορδή, στακύτταρα των νευρικών κρηπίδων, στο κάτω τοίχωμα του φάρυγγα, στο ραχιαίομεσοκάρδιο και μυοκάρδιο και λιγότερο στο ενδοκάρδιο και στα φαρυγγικά τόξαόπου έχουν μεταναστεύσει κύτταρα των νευρικών κρηπίδων. Στο στάδιο των 29σωμιτών (HH17), η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον τελεγκέφαλο,μυελεγκέφαλο και στο νευρικό σωλήνα. Η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρήστον αμφιβληστροειδή, λιγότερη στο φακό και έδειχνε μεγάλη ένταση στονκερατοειδή χιτώνα στον οφθαλμό, έντονη στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στομυοκάρδιο και αχνή στο ενδοκάρδιο στην καρδιά και έντονη στους σωμίτες, στομεσονέφρο και στις νησίδες αίματος. Σε μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων με τηχρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της neurocan προκάλεσε τανευροεξωδερμικά κύτταρα να επιδεικνύουν μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά και οεγκέφαλος να μην έχει αναπτυχθεί φυσιολογικά. Επίσης ανεστάλη ημορφογένεση της καρδιάς και των σωμιτών στα έμβρυα αυτά. Το mRNA της phosphacan άρχισε να ανιχνεύεται ήδη στο στάδιο τουμοριδίου (ΧΙ) και συνέχισε να εκφράζεται κατά την ανάπτυξη του πρώιμουεμβρύου. Ο ανοσοφθορισμός της phosphacan ήταν έντονος τόσο στηνεπιβλάστη όσο και την υποβλάστη στο στάδιο του βλαστιδίου (ΧΙΙΙ). Στο στάδιοτου προχωρημένου γαστρίδιο (ΗΗ4), ο φθορισμός ήταν ισχυρός στα κύτταραγύρω από την πρωτογενή αύλακα και στα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσα απότην πρωτογενή αύλακα. Στο στάδιο των 4 σωμιτών (ΗΗ8), ισχυρή έντασηφθορισμού ανιχνεύτηκε στις υπερυψωμένες νευρικές πτυχές ειδικότερα στηραχιαία επιφάνεια τους και αυτό μπορεί να δείχνει ότι ο ρόλος της phosphacanμπορεί να είναι σημαντικός στην σύντηξη των νευρικών πτυχών να σχηματίσουντο νευρικό σωλήνα. Επίσης, ισχυρή ένταση φθορισμού ανιχνεύτηκε στοεξώδερμα, μεσόδερμα και ενδόδερμα στο στάδιο αυτό. Στο στάδιο των 13σωμιτών (HH11), η phosphacan παρουσίασε ισχυρό φθορισμό στο νευρικόσωλήνα, στους σωμίτες, στο κάτω τοίχωμα του φάρυγγα, στο μυοκάρδιο,ενδοκάρδιο και ραχιαίο μεσοκάρδιο στην καρδιά και έντονος στις νησίδεςαίματος. Στο στάδιο των 29 σωμιτών (HH17), ο φθορισμός της phosphacan ήτανισχυρός στο μυελεγκέφαλο και διεγκέφαλο, στο φακό και τον αμφιβληστροειδήστον οφθαλμό, στο μυοτόμο αλλά όχι στο δερμοτόμο και σκληροτόμο στουςσωμίτες, στα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων, καθώς και στο μυοκάρδιο καιενδοκάρδιο στην καρδιά και στα τοιχώματα της ραχιαίας αορτής. Αναστολή τηςδράσης της phosphacan με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι αυτής έδειξε ότι ηphosphacan συμμετέχει στην σύντηξη των νευρικών πτυχών να σχηματίσουν τονευρικό σωλήνα, στην μορφογένεση του εγκεφάλου, στον καθορισμό τωνκυτταρικών πληθυσμών που δομούν τον οφθαλμό και στη μορφογένεση τηςκαρδιάς, του εντέρου και των σωμιτών.