Μεταβολή της απόπτωσης σε κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος in vivo και in vitro: επίδραση της πρωτεΐνης C στον αποπτωτικό μηχανισμό

Abstract

Introduction: Septic encephalopathy is a clinical feature that accompanies sepsis. Activated Protein C is used for the treatment of sepsis since it reduces the mortality. It has also antiapoptotic properties directly on neurons. However hemorrhage is its major side effect which limited its use only in critically ill patients. Protein C zymogen has the theoretical advantage that it is activated on site and on demand without inducing hemorrhage. Objective: The aim of the present Thesis was to evaluate the effect of protein C zymogen administration on survival from sepsis and its effect on brain from septic rats as well as on 14-3-3 neuronal expression. In addition the cytoprotective role of Protein C zymogen on thrombin-induced apoptosis of neuronal cultures was evaluated. Materials and Methods: 210 male Wistar rats were used. Sepsis was induced using the cecal ligation and puncture model. Ninety rats were used for survival analysis, randomized to receive either protein C zymogen administration at 11/2, 7 and 13 hours post CLP (n= 40, CLP+PC) or placebo (n=50, CLP). Animals were followed up for 60 hours. The rest 120 animals were also randomly divided in two groups either injected with protein C zymogen or placebo and were euthanatized at 6, 12, 24, 36, 48 και 60 hours post CLP. Brain was excised and it was either embedded in paraffin or stored at -80οC. Apoptosis was evaluated using 7-AAD by flow cytometry and immunohistochemically by assesing the expression of active caspase 3. Pro-apoptotic proteins such as bax, caspase 8 and cytochrome c as well as antipaoptotic proteins such as bcl-2 were also evaluated using immunohistochemistry. 14-3-3β and 14-3-3θ isoforms were measured using flow cytometry and immunohistochemistry. Neonatal rats were used for in vitro experiments of neurons and astrocytes. On day 8 post culture thrombin, thrombin and protein C zymogen or culture medium were added in cultures and apoptosis and necrosis of neurons and astrocytes were evaluated using flow cytometry. Results: Protein C zymogen administration increased survival of septic rats by 25% (CLP+PC vs CLP: 75% vs 50%, p=0.03). Furthermore it reduced neuronal apoptosis at 6 (p=0.04) and at 24 (p=0.0016) hours post CLP as well as active caspase 3 immunopositivity at 6 (p=0.012), 12 (p=0.026), 24 (p=0.018) and 36 hours (p=0.02). It also reduced bax immunopositivity at 6 hours (p=0.016), cytochrome c immunoreactivity at 6 (p=0.02) and 24 (p=0.016) hours and caspase 8 expression at 12 (p=0.045) hours post CLP while increased Bcl-2 expression at 24 (p<0.001) and at 60 (p<0.001) hours post CLP compare to non treated animals. Protein C zymogen was also reduced 14-3-3θ protein expression at 6 (p=0.008) and at 12 (p=0.016) hours post CLP as well as the 14-3-3β protein expression at 12 (p=0.016) hours. Finally protein C zymogen suspended thrombin induced apoptosis in neurons (p=0.001) and astrocytes (p<0.001) as well as necrosis in both population (neurons & astrocytes, p=0.024 & p=0.014 respectively). Conclusions: Protein C zymogen reduces mortality in an experimental model of sepsis and has directly cytoprotective effects directly on neurons and astrocytes. In addition sepsis alters neuronal 14-3-3θ and 14-3-3β expression which is modulated by protein C zymogen.

Εισαγωγή: Η σηπτική εγκεφαλοπάθεια αποτελεί μια νοσολογική οντότητα της σήψης. Η χρήση ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C στην θεραπεία της σήψης βελτίωσε την επιβίωση των σηπτικών ασθενών και έχει απευθείας αντιαποπτωτική δράση σε νευρώνες. Ωστόσο η αιμορραγική διάθεση που προκάλεσε είχε σαν αποτέλεσμα τον περιορισμό της χρήσης της σε βαριά πάσχοντες. Η πρόδρομη πρωτεΐνη C ενεργοποιείται όπου και όταν χρειάζεται και θεωρητικά είναι απαλλαγμένη από αιμορραγικές διαθέσεις. Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης της πρόδρομης πρωτεΐνης C στην επιβίωση από σήψη, η επίδραση της στην απόπτωση του εγκεφάλου και στην έκφραση των 14-3-3 πρωτεϊνών. Επιπλέον μελετήθηκε η κυτταροπροστατευτική της δράση στα νευρικά κύτταρα σε in vitro συνθήκες στα οποία προκλήθηκε απόπτωση με χορήγηση υψηλής δόσης θρομβίνης. Υλικό και Μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκαν 210 αρσενικοί επίμυες τύπου Wistar στους οποίους προκλήθηκε σήψη με την μέθοδο της τρώσης και απολίνωσης του τυφλού. Για την ανάλυση επιβίωσης χρησιμοποιήθηκαν 90 επίμυες οι οποίοι χωρίστηκαν σε 2 ομάδες: στην ομάδα παρέμβασης (ν=40) στους οποίους έγινε ενδοφλέβια έγχυση πρόδρομης πρωτεΐνης C στις 11/2, 7,13 ώρες από την πρόκληση της σήψης (CLP+PC) και στην ομάδα ελέγχου (ν=50) με χορήγηση placebo (CLP). Τα πειραματόζωα παρακολουθήθηκαν για 60 ώρες. Οι 120 εναπομείναντες επίμυες χωρίστηκαν και αυτοί σε 2 ομάδες ανάλογα με το αν θα ελάμβαναν πρόδρομη πρωτεΐνη C (CLP+PC) ή εικονική θεραπεία και θανατώθηκαν σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα 6, 12, 24, 36, 48 και 60 ώρες από την πρόκληση της σήψης (CLP). Απ’ όλα τα πειραματόζωα παρασκευάστηκε ο εγκέφαλος και εγκλείστηκε σε παραφίνη, είτε αποθηκεύθηκε στους -80οC. Η απόπτωση εκτιμήθηκε τόσο με 7-AAD και κυτταρομετρία ροής όσο και ανοσοϊστοχημικά μέσω της ενεργής κασπάσης 3. Επιπλέον μελετήθηκε η έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών bax, κασπάση 8 και κυτόχρωμα-c καθώς και του αντι-αποπτωτικού bcl-2. Τέλος μελετήθηκε και η έκφραση των ισομορφών β και θ των πρωτεϊνών 14-3-3. Για την in vitro μελέτη της επίδρασης της πρόδρομης πρωτεΐνης C χρησιμοποιήθηκαν καλλιέργειες νευρώνων-αστροκυττάρων που προέρχονταν από εγκεφάλους νεογέννητων επίμυων. Την 8η ημέρα καλλιέργειας πραγματοποιήθηκε επώαση με θρομβίνη, θρομβίνη και πρόδρομη πρωτεΐνη C ή απλή αλλαγή μέσου για 6 ώρες και μετρήθηκε η απόπτωση με κυτταρομετρία ροής σε νευρώνες και αστροκύτταρα. Αποτελέσματα: Η χορήγηση πρόδρομης πρωτεΐνης C αύξησε την επιβίωση από σήψη κατά 25% (CLP+PC vs CLP: 75% vs 50%, p=0,03). Επιπλέον μείωσε την απόπτωση των νευρώνων στις 6 (p=0,04) και τις 24 (p=0,0016) ώρες και την ενεργή κασπάση 3 στις 6 (p=0,012), 12 (p=0,026), 24 (p=0,018) και 36 ώρες (p=0,02). Ακόμη μείωσε την έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών bax στις 6 ώρες (p=0,016), του κυτοχρώματος c στις 6 (p=0,02) και 24 (p=0,016) ώρες και της κασπάσης 8 στις 12 (p=0,045) ενώ αύξησε την έκφραση του αντι-αποπτωτικού Bcl-2 στις 24 (p<0,001) και στις 60 (p<0,001) ώρες από την πρόκληση της σήψης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Τέλος η πρόδρομη πρωτεΐνη C είχε σαν αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασης της 14-3-3θ ισομορφής στις 6 (p=0,008) και τις 12 (p=0,016) ώρες από την πρόκληση της σήψης και την έκφραση της 14-3-3β ισομορφής στις 12 (p=0,016) ώρες. Τέλος η πρόδρομη πρωτεΐνη C ανέστειλε την από την θρομβίνη επαγόμενη απόπτωση τόσο στους νευρώνες (p=0,001) όσο και στα αστροκύτταρα (p<0,001) καθώς και την νέκρωση στους νευρώνες (p=0,024) και αστροκύτταρα ( p=0,014). Συμπεράσματα: Η χορήγηση την πρόδρομης πρωτεΐνης C μείωσε την θνητότητα από σήψη και είχε άμεση κυτταροπροστατευτική δράση στους νευρώνες και τα αστροκύτταρα. Επιπλέον η σήψη επάγει αλλαγές στην έκφραση των 14-3-3θ και 14-3-3β πρωτεϊνών στον εγκέφαλο τις οποίες μεταβάλλει η χορήγηση της πρόδρομης πρωτεΐνης C.