Μελέτη της επίδρασης του παράγοντα scrapie σε πειραματικά μοντέλα, σε άλλα είδη που έχουν προσβληθεί, καθώς και κυτταρικές σειρές που θα προκύψουν από αυτά

Abstract

Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) are fatal neurodegenerative diseases, afflicting a wide variety of species. All TSEs share a common pathogen and display similarities in both pathogenetic mechanisms and symptomatology. The pathogen is termed prion and is believed to consist primarily or mostly of the disease associated isoform of the prion protein (PrPSc). The normal isoform of the prion protein (PrPC) is a highly conserved membrane bound glycoprotein, expressed predominantly in the neurones. PrPC and PrPSc share the same primary structure, but differ in their higher structure: PrPC is α-helix-rich, whereas PrPSc is β-folded. Following infection, PrPSc molecules drive the conversion of PrPC to PrPSc, through an unidentified mechanism, leading to the appearance of symptoms. This thesis is divided in two sections. In the first section, we tried to characterize the glycosylation of PrPSc, whereas in the second we attempted to develop active immunization protocols against TSEs. To characterize PrPSc glycosylation, brain homogenates from infected animals were enriched in PrPSc using a newly devised protocol. The proteins in the homogenates were then electrophoresed and electrotransferred onto PVDF membranes and eventually blotted with biotinylated lectins. Two lectins, namely DSL and RCA I, were found to specifically recognize PrPSc. These lectins only recognized PrPSc subpopulations glycosylated with specific glycan moieties enabling recognition. It was found that PrPSc molecules originating from individuals afflicted with different TSEs, vary in the proportion of the subpopulations recognized by the lectins. These differences could be used as additional criteria for the discrimination between TSEs and provide insight on the importance of glycosylation for the conversion of PrPC to PrPSc and the transmission of TSEs. To develop active immunization protocols, wild type mice were immunized with recombinant murine PrP proteins, as well as a combination of recombinant murine prion protein and a recombinant bacterial heat shock protein. The production of antibodies against PrP, the type of immune response induced, the changes in the populations of immune cells in the spleens and the possible protective role in a murine model of TSEs were assessed. Of the immunization protocols evaluated, one of them lead to the production of antibodies recognizing both recombinant murine PrP and PrP from TSE afflicted animals, however it failed to provide protection in the murine TSE model. Using a different immunization protocol, partial protection against TSEs in the murine model was achieved, although neither humoral nor cellular immune response against PrP were elicited in the immunized mice. Immune functions in these mice were compromised and it was found that the population of mature follicular dendritic cells was severely depleted. Given the crucial role of mature follicular dendritic cells in the pathogenesis of TSEs, the partial protection observed in the murine TSE model should be linked with the observed depletion of mature follicular dendritic cells. The mechanism underlying depletion of these cells is not clear, however targeting mature follicular dendritic cells could prove to be a viable approach for treating TSEs.

Οι Μεταδιδόμενες Σπογγώδεις Εγκεφαλοπάθειες (ΜΣΕ) είναι χρόνιες θανατηφόρες νευροεκφυλιστικές νόσοι, που πλήττουν πληθώρα ειδών. Ο παθογόνος παράγοντας στις ΜΣΕ είναι κοινός, ενώ ομοιότητες παρατηρούνται και στους παθογενετικούς μηχανισμούς και τη συμπτωματολογία. Ο παθογόνος παράγοντας πιστεύεται ότι αποτελείται αποκλειστικά ή μερικά από την παθολογική ισομορφή (PrPSc) της φυσιολογικής πρωτεΐνης prion (PrPC). Η PrPC είναι μία υψηλά συντηρημένη μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, η οποία εκφράζεται σε διάφορους ιστούς και ιδιαίτερα στους νευρώνες. Η PrPC και η PrPSc, χαρακτηρίζονται από την ίδια πρωτοταγή δομή, αλλά διαφέρουν ως προς τη διαμόρφωση στο χώρο: η PrPC είναι πλούσια σε α-έλικες, ενώ η PrPSc σε β-πτυχωτά φύλλα. Πιστεύεται ότι κατά την προσβολή από τις ΜΣΕ η PrPSc μετατρέπει -μέσω άγνωστου μηχανισμού-μόρια της PrPC σε PrPSc, γεγονός που οδηγεί στην εμφάνιση συμπτωμάτων. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελείται από δύο μέρη. Στο πρώτο μελετήθηκε η γλυκοσυλίωση της PrPSc, ενώ στο δεύτερο έγινε προσπάθεια ανάπτυξης πρωτοκόλλων ενεργητικής ανοσοποίησης έναντι των σπογγωδών εγκεφαλοπαθειών. Για το χαρακτηρισμό της γλυκοσυλίωσης αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα εμπλουτισμού ομογενοποιημάτων εγκεφάλων προσβεβλημένων ατόμων σε PrPSc και ακολούθως -κατόπιν ηλεκτροφορητικής ανάλυσης και ηλεκτρομεταφοράς των πρωτεϊνών σε μεμβράνες- προσδιορίστηκε το είδος των συνδεδεμένων στην PrPSc σακχάρων, με τη χρήση λεκτινών. Ταυτοποιήθηκαν δύο λεκτίνες, οι DSL και RCA I, που αναγνωρίζουν και συνδέονται εκλεκτικά με συγκεκριμένους υποποληθυσμούς μορίων της PrPSc, τα οποία είναι γλυκοσυλιωμένα με συγκεκριμένα σάκχαρα, ώστε να είναι δυνατή αυτή η αναγνώριση. Μάλιστα διαπιστώθηκε ότι πληθυσμοί μορίων της PrPSc προερχόμενοι από άτομα προσβεβλημένα με διαφορετικές μορφές ΜΣΕ, διαφέρουν ως προς την αντιπροσώπευση των επιμέρους υποπληθυσμών που αναγνωρίζονται από τις χρησιμοποιούμενες λεκτίνες. Οι διαφορές αυτές θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως πρόσθετα κριτήρια για την ταχεία διαφοροδιάγνωση μεταξύ των διαφορετικών μορφών ΜΣΕ, ενώ πιστεύεται ότι παρέχουν ενδείξεις αναφορικά με τη σημασία της γλυκοσυλίωσης στη μετατροπή της PrPC σε PrPSc και κατ' επέκταση στην ευκολία ή/και δυνατότητα μετάδοσης των νόσων μεταξύ ατόμων διαφορετικού είδους. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής, το ενδιαφέρον μετατοπίστηκε στην πρόληψη/θεραπευτική αντιμετώπιση των ΜΣΕ μέσω ανάπτυξης πρωτοκόλλων ενεργητικής ανοσοποίησης. Για το σκοπό αυτό ανοσοποιήθηκαν μυς άγριου τύπου με διαφορετικές μορφές ανασυνδυασμένων prion πρωτεϊνών, καθώς και με συνδυασμό ανασυνδυασμένης βακτηριακής πρωτεΐνης θερμικής καταπόνησης με την ανασυνδυασμένη prion πρωτεΐνη μυός και ελέγχθηκε η επαγωγή σύνθεσης αντισωμάτων που αναγνωρίζουν την PrP, το είδος της επαγόμενης ανοσολογικής απόκρισης, η επίδραση της ανοσοποίησης σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ενώ εκτιμήθηκε η πιθανή προστατευτική δράση έναντι των μεταδιδόμενων σπογγωδών εγκεφαλοπαθειών σε πειραματικό μοντέλο των νόσων σε μυς. Κατά την ανοσοποίηση των μυών επετεύχθη επαγωγή της σύνθεσης αντισωμάτων έναντι της PrP, ωστόσο τα αντισώματα δεν παρείχαν προστασία στο χρησιμοποιηθέν πειραματικό μοντέλο. Μερική προστασία επετεύχθη εφαρμόζοντας διαφορετικό πρωτόκολλο ανοσοποίησης, το οποίο δεν προκάλεσε επαγωγή χυμικής ή κυτταρικής ανοσίας. Απεναντίας στην περίπτωση αυτή παρατηρήθηκε καταστολή λειτουργιών του ανοσοποιητικού, με σημαντική μείωση του αριθμού των ώριμων λεμφοζιδιακών δενδριτικών κυττάρων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι κατόπιν προσβολής ο παθογόνος παράγοντας πολλαπλασιάζεται κατεξοχήν στα ώριμα λεμφοζιδιακά δενδριτικά κύτταρα, μείωση του αριθμού τους οδηγεί στην καθυστέρηση της εξέλιξης της νόσου. Ο μηχανισμός μείωσης του αριθμού των ώριμων λεμφοζιαδιακών δενδριτικών κυττάρων μέσω της ανοσοποίησης παραμένει αδιευκρίνιστος, ωστόσο η μείωσή τους ενδεχομένως να αποτελούσε θεραπευτικό στόχο.