Η αξιολόγηση της χρήσης βιοδεικτών στην αναγνωρισιμότητα των ζωικών προϊόντων: η χρήση των τερπενίων στο γάλα και τα προϊόντα του

Abstract

Recently there has been an increasing consumer’s demand for products of specific quality and hence for certification of the origins of the food they consume. Terpenes have been proposed as biomarkers of a grass based diet. In a 20 days experiment, 8 adult sheep and 8 adult goats were divided in two equal groups, representing control (C) and treatment (T) group. In the treatment group oral administration of 1g of each terpene, α-pinene, limonene and b-caryophyllene, were applied daily. Milk production was recorded daily and blood plasma and milk samples were also collected. Blood plasma samples were extracted with organic solvents and the Solid Phase Micro-extraction Method using CAR/PDMS fiber was used for milk samples, before terpenes were identified on a GC-MS. Milk chemical properties and fatty acid profile were also determined. The results indicated terpenes not having an effect on milk production and milk chemical properties. Dosed terpenes were identified in blood plasma, milk and cheese of the treatment (T) group of animals in both species. Fatty acids analysis obtained from goats’ milk showed significant differences on C10 (P<0.05), C18 (P<0.05) and CLA (P<0.001) while sheep fatty acids profile differed significantly for C18 (P<0.05). Following that, terpenes degradation rates were evaluated in vitro in rumen fluid of adapted and non adapted animals in a 6 weeks trial. During the week 1 and 2 animals were receiving diet with no terpenes addition while on weeks 3 and 4 animals were orally dosed with 1g of each of the following terpenes, α-pinene, limonene and b-caryophyllene. Terpenes pooled mean degradation rate of α-pinene in rumen fluid showed a trend for higher degradation rate in the 5th week compared to the 2nd and 3rd week of the experiment, while for limonene degradation rate was significantly (P=0.032) higher in week 5 compared to the 1st experimental week. Regarding the degradation rate of β-caryophyllene during the 6 weeks of the experiment there were no significant differences. Finally, the potential cytotoxic effect of all three terpenes, α-pinene, limonene and β- caryophyllene was evaluated using the rabbit kidney cell line RK13. The results indicated that terpenes had a potential cytotoxic effect on concentrations above 50 μg/m. In conclusion, monoterpenes α-pinene and limonene can be integrated in certification schemes as biomarkers in animal products, but always used together with other indicators such as fatty acids.

Η αναγνωρισιμότητα αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες διασφάλισης της ποιότητας των ζωικών προϊόντων και η εργαστηριακή επιβεβαίωσή της είναι απαραίτητο εργαλείο στη διαδικασία. Για την αναγνώριση της προέλευσης έχει προταθεί η χρήση βιοδεικτών δηλαδή ενώσεων που δεν συντίθενται από τον οργανισμό του ζώου και η ανίχνευσή τους στο ζωικό προϊόν οφείλεται αναμφίβολα στο σιτηρέσιο που έχουν καταναλώσει. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της χρήσης των τερπενίων ως βιοδεικτών για το γάλα και τα προϊόντα του. Κατά τον πρώτο πειραματισμό 8 ενήλικες υγιείς αίγες και 8 προβατίνες αντίστοιχα, χωρίστηκαν σε δύο ισοδύναμες ομάδες, του μάρτυρα (C) και της επέμβασης (T). Στα ζώα των ομάδων T χορηγήθηκε ημερησίως ποσότητα 1g από κάθε ένα από τα τερπένια: α-πινένιο, λεμονένιο και β-καρυοφυλλένιο, για χρονικό διάστημα 18 ημερών. Διερευνήθηκε η παρουσία τους στο πλάσμα του αίματος, το γάλα και το τυρί των δύο ειδών ζώων. Οι αιμοληψίες πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 ωρών και στη συνέχεια κάθε 2η ημέρα και από τις δύο ομάδες ζώων τόσο για τις αίγες όσο και για τα πρόβατα. Τα τερπένια εκχυλίστηκαν από το πλάσμα με τη χρήση πετρελαϊκού αιθέρα και προσδιορίστηκαν σε GC/MS. Η παραγωγή γάλακτος και η ποιότητά του, ως προς τις βασικές χημικές παραμέτρους, το προφίλ των λιπαρών οξέων και τις ιδιότητες πήξης, παρακολουθούνταν συστηματικά σε ατομικό επίπεδο στα ζώα. Για τον προσδιορισμό των τερπενίων στο γάλα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της μικροεκχύλισης στερεάς φάσης (SPME) σε συνδυασμό με συσκευή GC/MS. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν περιοδικά τυροκομήσεις και παρασκευάστηκε Κεφαλοτύρι το οποίο αφέθηκε να ωριμάσει πριν προσδιοριστούν τα βασικά χημικά χαρακτηριστικά, το προφίλ των λιπαρών οξέων και οι συγκεντρώσεις των τερπενίων που χρησιμοποιήθηκαν. Τα μονοτερπένια ανιχνεύτηκαν σε όλα τα δείγματα του πλάσματος, στο γάλα και στο τυρί των ομάδων T και στα δύο είδη ζώων, ενώ το β-καρυοφυλλένιο είτε δεν ανιχνεύτηκε καθόλου, είτε προσδιορίστηκε σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Κανένα από τα παραπάνω τερπένια δεν ανιχνεύτηκε στο αίμα και στο γάλα των ζώων της ομάδας C και για τα δύο είδη ζώων. Η γαλακτοπαραγωγή και τα χημικά χαρακτηριστικά του γάλακτος δεν παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες C και T και για τα δύο είδη ζώων, ενώ παρατηρήθηκαν ορισμένες διαφορές (P<0,05) ως προς τα χαρακτηριστικά πήξεως του γάλακτος. Παρατηρήθηκαν επίσης στατιστικώς σημαντικές διαφορές σε ορισμένα από τα λιπαρά οξέα (C10 (P<0,05) C18 (P<0,05) και 13 CLA (P<0,001) στις αίγες και στο C18 (P<0,05) στα πρόβατα) στο λίπος του γάλακτος μεταξύ των ομάδων C και T. Κατά το δεύτερο πειραματισμό διερευνήθηκε η δυνατότητα του υγρού της μεγάλης κοιλίας να αποδoμεί τα τερπένια in vitro κάτω από διαφορετικές συνθήκες (προσαρμογή των ζώων ή όχι). Δύο τράγοι και δύο κριοί διατράφηκαν με συμβατικό σιτηρέσιο επί δύο εβδομάδες. Στη συνέχεια κατά την 3η και 4η εβδομάδα τα ζώα ελάμβαναν 1g ημερησίως από κάθε ένα από τα υπό μελέτη τερπένια: α-πινένιο, λεμονένιο και β-καρυοφυλλένιο και τέλος τα ζώα παρέμειναν στο πείραμα για δύο ακόμη εβδομάδες χωρίς τη χορήγηση τερπενίων. Με τη χρήση οισοφαγικού καθετήρα πάρθηκαν δείγματα υγρού μεγάλης κοιλίας στο τέλος κάθε εβδομάδας. Τα δείγματα επωάστηκαν για 24 ώρες in vitro με την προσθήκη 100μg/ml των τερπενίων σε αυτά και προσδιορίστηκε ο ρυθμός αποδόμησής τους είτε με την παρουσία υγρού μεγάλης κοιλίας είτε με ρυθμιστικό διάλυμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και τα τρία τερπένια αποδομούνται in vitro στατιστικά σημαντικά (P<0,05) περισσότερο από το υγρό της μεγάλης κοιλίας και ότι η προσθήκη εξωγενών τερπενίων στο σιτηρέσιο των ζώων δεν επηρέασε στατιστικά σημαντικά το ρυθμό αποδόμησής τους στο αντίστοιχο υγρό M.K in vitro. Τέλος διερευνήθηκε η κυτταροτοξική δράση των υπό μελέτη τερπενίων στη συνεχή κυτταρική σειρά RK-13 με τη χρήση της μεθόδου ΜΤΤ Η έκθεση των κυττάρων σε συγκεντρώσεις τερπενίων μεγαλύτερες από 50 μg/ml προκάλεσε σημαντική μείωση του αριθμού των μεταβολικά ενεργών κυττάρων. Το γεγονός αυτό παρατηρήθηκε τόσο στην περίπτωση που κάθε τερπένιο εφαρμόστηκε χωριστά όσο και στην περίπτωση της ταυτόχρονης εφαρμογής τους. Συνάγεται ότι τα τερπένια μεταφέρονται αυτούσια στο γάλα και τα προϊόντα του αν και όχι ποσοτικά, ενώ παρατηρούνται διαφορές μεταξύ τους (μονοτερπένια-σεσκιτερπένια) και μεταξύ των ειδών ζώων. Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι τα τερπένια είναι βιολογικά δραστικές ενώσεις που παρουσιάζουν κυτταροτοξικότητα και μεταβολίζονται στο περιβάλλον της Μ.Κ. Τα μονοτερπένια α-πινένιο και λεμονένιο θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την αναγνωρισιμότητα των ζωικών προϊόντων. Ωστόσο, η χρήση τους θα έδινε πιο ασφαλή συμπεράσματα για το γάλα και τα προϊόντα του στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται συνδυαστικά με άλλα συστατικά όπως για παράδειγμα τα λιπαρά οξέα του λίπους του γάλακτος