Διερεύνηση του μηχανισμού της αιμοποίησης στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα με μακράς διάρκειας καλλιέργειες μυελού των οστών: επίδραση αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών

Abstract

Myelodysplastic syndromes comprise a heterogeneous group of hematopoietic stem-cell disorders, with dismal prognosis and difficulty in their therapeutic approach. Their classification according to FAB co-operative study group initially, and more recently according to WHO, as well as the application of several prognostic scoring systems, aim to predict the time to evolution to acute leukemia and the overall survival. The main therarapeutic approach is based on the supportive care and the use of hematopoietic growth factors, whereas many other factors have been used, in an effort to differentiate the dysplastic clone. The revealing of the underlying pathogenetic mechanisms, which are implicated in the impaired hematopoiesis of these syndromes, is crucial for the development a more comprehensive and effective treatment approaches. The study of hematopoiesis in vitro can be accomplished by several methods, but mainly by hematopoietic progenitor-cell cultures performed in various conditioned mediums, by using cells derived from the peripheral blood or bone marrow. Short term cultures are useful for the study and development of the commited progenitors, while long term cultures provide the possibility of development to the more primitive pluripotent stem cells, on a cell environment, consisting of accessory cells, implicated in the creation of the marrow microenvironment in vivo. Long term cultures comprise the more relevant in vitro model of hematopoiesis, and they greatly contribute to the understanding of cellular interactions between hematopoietic and stromal cells. The aim of this thesis was the study of hematopoiesis of MDS, by using long term cultures of hemopoietic cells and the investigation of the influence of various exogenous modulating factors-drugs in vitro, in an effort to obtain results, which could direct their use in vivo. Short term cultures in methylcellulose revealed the disability of the progenitor cells of patients to form colonies of equal size and number to those of normal controls, and this disability was more prominent in high risk patients, such as RAEB and RAEB-t. The addition of erythropoietin and of a mixture of growth factors in the conditioned medium had a positive influence in the majority of cases, which was more prominent than the corresponding of the normal controls. Attempting to use the in vitro data, as a predictive model of the in vivo response to combination therapy with erythropoietin plus G-CSF, hematopoietic cells of patients with RARS were cultured and the impact of the growth factors-enriched medium on the formation of colonies was compared with the in vivo response. No correlation between in vitro and in vivo results was found, and this was attributed to the different composition of the combination of hematopoietic growth factors added to the cultures, which is not yet available for in vivo use. The aim of this thesis was the study of in vitro hematopoiesis of MDS patients using mainly long term cultures. First, we compared the results obtained from patients with MDS, with those obtained from normal controls, and then the results were compared between the different subgroups of the FAB classification. For this comparison 4 growth parameters of the culture were used: the extent of the area of the stroma-layer formed, the longevity of the culture, the weekly cell production in the supernatant medium and the total cell yield of each culture. In all cases the development of cultures derived from patients was inferior to those of controls, as it could be estimated by the four above-mentioned parameters. The model was much more worse in patients suffering from RAEB and RAEB-t, in comparison to the model obtained from patients belonging to other FAB subgroups. The addition of modulating factors to the culture medium was aimed to improve the above parameters and their choice was based on data emerging from the literature, where a favorable influence on the patients’ hematopoiesis, as well as a differentiation effect on their progenitors in vitro had been confirmed. IFN-α, used in two different concentrations, did not improve the results in comparison to the controls, while -especially in the higher concentration- it had a clear cell-toxic effect. The same results were obtained with the addition of arabinosylcytosine, in two different concentrations, as well as with the combination of IFN-α and aracytine. The addition of vitamin D3 had no significant impact, since it did not improve any of the culture’s parameter. The addition of IL-3 had a clearly favorable effect in the majority of cases, increasing, mainly the weekly and the total cell yield of the culture’s supernatant, and to a lesser degree improving the other parameters of the culture. However, in a subgroup of high-risk patients, very high cell yield was associated to patient’s evolution to a more aggressive syndrome or acute myelogenous leukemia, implying that IL-3 might probably enhance clonal expansion of the blast cell population. Interleukin-6 had similarly a favourable effect, but this was particularly prominent in the stroma-cell formation and to a lesser degree in the other culture parameters. The combination of IL-3 plus IL-6 was proved as the most important favourable modulator of the MDS cultures. It improved all culture parameters in the vast majority of patients, and produced statistically significant differences in comparison to the control cultures. Therefore, a clear synergy between the two interleukins was observed, particularly in the extent and the overall quality of the stroma formation, which had a positive impact on all the remaining culture parameters used for the evaluation of the long term cultures. By using the combination of IL-3 plus IL-6 the development of the stroma-cell layer approached and in some cases reached the level of development of the normal controls. The improvement of the total cell yield was not significantly different of that observed by the addition of IL-3 alone, a finding implying that this cytokine is the main regulator of cell proliferation. According to the developmental model obtained by the long-term culture and the response to the modulators added, two different patterns of in vitro growth could be distinguished: The dysplastic model, which is characterized by some degree of stroma formation, however rapidly degenerated during the 5th to 6th week, and incapable to support a strong culture system, and a corresponding low cell-yield in the supernatant. This model in some cases can approach the normal growth pattern, from which it generally differs rather quantitatively. The second is the leukemic model, which is characterized by a complete inability for stroma formation, short overall longevity of the culture, and high cell yield during the first two weeks, attributed to the initially inoculated committed progenitor cells in the culture. The MDS patients’ stroma-cell layer has a distinct cytokine profile, characterized by the absence of GM-CSF expression and a low expression of SCF, TGF-β and TNF-α. In conclusion, long term cultures of hematopoietic cells of patients with MDS represent a useful prognostic tool and can distinguish patients who will more rapidly evolve to leukemia from those who will have a more prolonged and stable clinical course. The use of a combination of cytokines and other factors might have a favourable effect on the impaired in vitro hematopoiesis of the progenitor cells of patients with MDS.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα αποτελούν ετερογενή ομάδα νοσημάτων, με δυσμενή πρόγνωση και δυσκολία θεραπευτικής προσέγγισης. Η ταξινόμηση των ΜΔΣ κατά FAB αρχικά και πιο πρόσφατα κατά WHO και η επινόηση διαφόρων προγνωστικών συστημάτων, αποσκοπούν στην πρόβλεψη του χρόνου της εξέλιξης προς οξεία λευχαιμία και της συνολικής επιβίωσης. Η θεραπευτική προσέγγιση βασίζεται κυρίως στην υποστηρικτική αγωγή και στη χορήγηση αυξητικών παραγόντων, ενώ πολλοί παράγοντες έχουν χρησιμοποιηθεί, με στόχο τη διαφοροποίηση του δυσπλαστικού κλώνου. Η κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που διέπουν την παθολογική αιμοποίηση που παρατηρείται στα σύνδρομα αυτά in vitro και in vivo, μπορεί να βοηθήσει στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπισή τους. Η μελέτη της αιμοποίησης in vitro επιτυγχάνεται με διάφορες μεθόδους, οι κυριότερες εκ των οποίων είναι οι καλλιέργειες προγονικών κυττάρων περιφερικού αίματος και μυελού, σε διάφορα καλλιεργητικά υλικά. Οι καλλιέργειες σύντομης διάρκειας χρησιμεύουν για την ανάπτυξη δεσμευμένων προγονικών κυττάρων, ενώ οι καλλιέργειες μακράς διάρκειας δίνουν τη δυνατότητα ανάπτυξης και των αρχέγονων – στελεχιαίων κυττάρων σε υπόστρωμα που αποτελείται από κύτταρα υπεύθυνα για τη δημιουργία του μικροπεριβάλλοντος του μυελού. Αποτελούν το πλησιέστερο in vitro μοντέλο της αιμοποίησης, και η κυριότερη συμβολή τους είναι η μελέτη της αλληλεπίδρασης αιμοποιητικών και κυττάρων του στρώματος. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η μελέτη της αιμοποίησης των ΜΔΣ με τη μέθοδο των καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων μακράς διάρκειας και η επίδραση διαφόρων παραγόντων στην in vitro αιμοποίηση, με στόχο την αναγωγή των ευρημάτων και στην in vivo διαδικασία. Οι καλλιέργειες βραχείας διάρκειας σε μεθυλοκυτταρίνη ανέδειξαν την αδυναμία των προγονικών κυττάρων των ασθενών να δημιουργήσουν αποικίες σε αριθμό και μέγεθος εφάμιλλο των φυσιολογικών μαρτύρων, και η αδυναμία αυτή αφορούσε περισσότερο τα υψηλότερου κινδύνου σύνδρομα, όπως RAEB και RAEB-t. Η προσθήκη ερυθροποιητίνης και μίγματος αυξητικών παραγόντων στο καλλιεργητικό υλικό είχε θετική επίδραση στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, και μάλιστα σε μεγαλύτερο βαθμό από αυτήν που παρατηρήθηκε στα δείγματα των μαρτύρων. Σε μια προσπάθεια χρησιμοποίησης των in vitro δεδομένων για την πρόβλεψη της in vivo απάντησης των ασθενών στην χορήγηση ερυθροποιητίνης και G-CSF, καλλιεργήθηκαν κύτταρα ασθενών με RARS και αξιολογήθηκε η βελτίωση των αποικιών που παρατηρήθηκε με τη χρήση του συνδυασμού σε σύγκριση με την ανταπόκριση των ασθενών in vivo. Δε βρέθηκε συσχέτιση της in vitro με την in vivo επίδραση, και το εύρημα αποδόθηκε στην διαφορετική σύνθεση του συνδυασμού που προστέθηκε στις καλλιέργειες με επιπλέον παράγοντες, μη διαθέσιμους ακόμη για in vivo χορήγηση. Οι μακράς διάρκειας καλλιέργειες αποτέλεσαν το κύριο αντικείμενο της διατριβής. Αρχικά συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα των καλλιεργειών ΜΔΣ με αυτά φυσιολογικών μαρτύρων και στη συνέχεια τα αποτελέσματα των υποκατηγοριών ΜΔΣ κατά FAB μεταξύ τους. Για την σύγκριση χρησιμοποιήθηκαν 4 παράμετροι ανάπτυξης της καλλιέργειας: η έκταση του σχηματιζόμενου στρώματος, η διάρκεια ζωής, η εβδομαδιαία και η συνολική κυτταρική απόδοση στο υπερκείμενο. Σε όλες τις περιπτώσεις η ανάπτυξη υπολειπόταν ποιοτικά και ποσοτικά στους ασθενείς, σε σχέση με τους μάρτυρες ως προς και τις 4 παραμέτρους αξιολόγησης που χρησιμοποιήθηκαν, και μάλιστα ήταν σημαντικά χειρότερη στους πάσχοντες από RAEB και RAEB-t, σε σχέση με τους ασθενείς των υπόλοιπων κατηγοριών κατά FAB. Η προσθήκη παραγόντων στο καλλιεργητικό υλικό αποσκοπούσε στη βελτίωση των παραμέτρων που προαναφέρθηκαν και η επιλογή τους βασίσθηκε σε βιβλιογραφικά δεδομένα, που ανέφεραν ευνοϊκή επίδραση στην αιμοποίηση των ασθενών ή διαφοροποιητική δράση στα προγονικά κύτταρά τους in vitro. Η IFN-α σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις, δεν βελτίωσε τα αποτελέσματα σε σχέση με τα control, ενώ – ιδίως στην υψηλότερη συγκέντρωση – είχε τοξική επίδραση στα κύτταρα. Το ίδιο συνέβη και με την προσθήκη αρασυτίνης, επίσης σε δύο συγκεντρώσεις, καθώς και με τον συνδυασμό αυτής με IFN-α. Η προσθήκη βιταμίνης D3 δεν έδωσε επίσης ουσιώδη αποτελέσματα αφού δεν τροποποίησε προς το καλύτερο καμιά παράμετρο της καλλιέργειας. Η προσθήκη IL-3 είχε σαφή ευοδωτική επίδραση στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, αυξάνοντας κυρίως τις κυτταρικές αποδόσεις και σε μικρότερο βαθμό τις άλλες παραμέτρους της καλλιέργειας. Ωστόσο, σε ορισμένους ασθενείς υψηλού κινδύνου, πολύ υψηλές κυτταρικές αποδόσεις συνδυάζονταν με εκτροπή των ασθενών προς επιθετικότερο σύνδρομο ή οξεία λευχαιμία, υποδηλώνοντας ότι η IL-3 πιθανώς να ευόδωνε τον κλωνικό πληθυσμό αώρων κυττάρων. Η IL-6 είχε επίσης ευοδωτική δράση, η οποία αφορούσε κυρίως τον σχηματισμό στρώματος και λιγότερο τις άλλες παραμέτρους των καλλιεργειών. Ο συνδυασμός IL-3+IL-6 απέβη ο πιο σημαντικός τροποποιητής της συμπεριφοράς των καλλιεργειών των ασθενών με ΜΔΣ. Ευόδωσε όλες τις παραμέτρους στην μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών και προκάλεσε διαφορές πολύ σημαντικές σε σχέση με την control καλλιέργεια. Αναδείχθησαν λοιπόν ευρήματα συνέργειας των δύο ιντερλευκινών, κυρίως στην έκταση και την ποιότητα του σχηματιζόμενου στρώματος, που είχε αντίκτυπο σε όλες τις άλλες παραμέτρους αξιολόγησης των καλλιεργειών μακράς διάρκειας. Με τον συνδυασμό IL-3 και IL-6 η ανάπτυξη του στρώματος προσέγγισε περισσότερο, και σε ορισμένες περιπτώσεις έφθασε την αντίστοιχη των μαρτύρων. Η βελτίωση της κυτταρικής απόδοσης δεν διέφερε σημαντικά από αυτήν που αποκτήθηκε με την IL-3 μόνο, κάτι που σημαίνει ότι ο κύριος ρυθμιστής της κυτταρικής απόδοσης ήταν η IL-3. Με βάση τον τρόπο ανάπτυξης και την συμπεριφορά των κυττάρων των ασθενών με ΜΔΣ στην προσθήκη των κυτταροκινών, διακρίθηκαν δύο κυρίως μοντέλα in vitro ανάπτυξης της καλλιεργειών: Το δυσπλαστικό μοντέλο, που χαρακτηρίζεται από κάποιου βαθμού σχηματισμό στρώματος, το οποίο όμως εκφυλίζεται συνήθως την 5η-6η εβδομάδα, αποδίδει χαμηλή κυτταρικότητα στο υπερκείμενο, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να πλησιάζει και προς το φυσιολογικό, από το οποίο σε γενικές γραμμές υστερεί κυρίως ποσοτικά, και το λευχαιμικό, που χαρακτηρίζεται από αδυναμία σχηματισμού στρώματος, βραχεία διάρκεια ζωής της καλλιέργειας και υψηλές κυτταρικές αποδόσεις τις 2 πρώτες εβδομάδες, που οφείλονται στην μεγάλη ανάπτυξη των περιεχόμενων στον αρχικό ενοφθαλμισμό κλωνογονικών κυττάρων. Το στρώμα των ασθενών με ΜΔΣ εκφράζει προφίλ κυτταροκινών που χαρακτηρίζεται από απουσία έκφρασης GM-CSF και χαμηλή έκφραση SCF, TGF-β και TNF-α. Συμπερασματικά οι μακράς διάρκειας καλλιέργειες στους ασθενείς με ΜΔΣ αποτελούν χρήσιμη προγνωστική μέθοδο και μπορούν να διακρίνουν τους ασθενείς που θα εξελιχθούν ταχέως, από εκείνους που θα έχουν χρονιότερη και ηπιότερη πορεία. Συνδυασμός κυτταροκινών και άλλων παραγόντων μπορεί να βελτιώσει την προβληματική-παθολογική in vitro αιμοποίηση των προγονικών κυττάρων των ασθενών με ΜΔΣ.