Αλληλεπίδραση υποδοχέων ντοπαμίνης με ιοντοτρόπους υποδοχείς γλουταμινικού οξέος και γ-αμινοβουτυρικού οξέος στον προμετωπιαίο φλοιό και ιππόκαμπο επίμυος

Abstract

Dopaminergic innervation is critical for long term changes in synaptic efficacy in hippocampus and prefrontal cortex (PFC), as well as for learning-associated immediate-early gene expression. Many studies have demonstrated that the interactions between dopamine and glutamate receptors are essential for the prefrontal cortical (PFC) and hippocampal cognitive functions. In order to understand the molecular basis of dopamine/glutamate interactions in rat PFC and hippocampus, we investigated the effect of “in vitro” dopamine D1 receptor stimulation on glutamate NMDA and AMPA receptor subunits’ phosphorylation, as well as on ERK1/2 (Extracellular Regulated Kinase1/2) and DARPP-32 (Dopamine-and cyclicAMP-Regulated PhosphoProtein-32) phosphorylation/activation. Furthermore, we compared the D1/NMDA/AMPA receptor interactions seen in PFC and hippocampus with those appearing in striatum, in which the D1 receptors’ density is the highest within the mammalian brain. Our results showed that stimulation of D1 receptor by the specific agonist SKF38393 (10μM) in PFC and hippocampal slices significantly increased the phosphorylation state of: a) NR1ser897 and NR2Bser1303 subunits of NMDA receptor, which promotes the trafficking and enhances the ionic currents, respectively, b) of GLUR1(ser831 and ser845) subunit of AMPA receptor, which enhances the receptor currents and the open probability of the receptor channel and c) of ERK1/2, but not of DARPP-32. Interestingly, co-stimulation of D1 and NMDA receptors with an ineffective dose of SKF38393(2μM) and NMDA(5μM) respectively, elevated further the phosphorylation level of NMDA and AMPA receptor subunits, as well as of ERK1/2, but not of DARPP-32. The D1- and D1/NMDA-induced phosphorylations were totally inhibited by SL327 (specific ERK1/2 inhibitor). Conversely, in striatal slices our data confirm that the D1-mediated phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits relies on D1/PKA/DARPP-32 signalling. In conclusion, in PFC and hippocampus: a) a strong synergistic interaction of D1 and NMDA receptors exists, which results in a significant ERK1/2 pathway activation, b) The D1 and the D1/NMDA receptor induced phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits seems to rely on ERK1/2 signalling and could to some extend underlie the enhancement of NMDA and AMPA receptor currents mediated by D1 receptor activation. In order to investigate whether this synergistic interaction occurs also “in vivo” and to further examine its functional significance, we exposed the rats to a novel environment (open field exploration), which is known to evoke dopamine release in hippocampus and PFC. Our results showed that the “spatial” novelty stimulus induced in rat hippocampus and PFC: a) a significant increase in phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits, as well as a robust phosphorylation/activation of ERK1/2 signalling, which are both dependent on the concomitant stimulation of D1/NMDA receptors and are both abolished by habituation, b) chromatin remodeling events (phosphorylation-acetylation of histone H3) and c) an increase in the immediate early genes cFos and zif268 expression in the CA1 region of hippocampus, which is dependent on the coactivation of D1/NMDA and muscarinic acetylcholine receptors. Our results indicate that: a) the phosphorylation of NMDA and AMPA receptor subunits could act as a ‘novelty detector’, since it is absent after habituation, b) the robust activation of ERK1/2 signalling elicited by “spatial” novelty, demands the synergistic interaction of D1/NMDA receptors and c) the activation of ERK1/2 pathway leads to chromatin remodeling events and expression of the immediate early genes cFos and zif268, which are required for the regulation of synaptic plasticity and memory consolidation.

Η ντοπαμινεργική νεύρωση είναι πολύ σημαντική για τις μακροχρόνιες αλλαγές της συναπτικής πλαστικότητας στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό, καθώς και για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων που σχετίζονται με τη μνήμη και τη μάθηση. Πολλές εργασίες έχουν δείξει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ντοπαμινεργικών και γλουταμινεργικών υποδοχέων είναι ιδιαίτερα σημαντικές για τις γνωστικές λειτουργίες του ιππόκαμπου και του προμετωπιαίου φλοιού. Προκειμένου να μελετήσουμε το μοριακό υπόβαθρο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ντοπαμινεργικών και γλουταμινεργικών υποδοχέων στο ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο φλοιό του επίμυος, εξετάσαμε «in vitro» την επίδραση της ενεργοποίησης των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης στο επίπεδο φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων γλουταμινικού οξέος., καθώς στην φωσφορυλίωση/ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης (Extracellular Regulated Kinase1/2) και της DARPP-32 (Dopamine-and cyclicAMP-Regulated PhosphoProtein-32). Επιπλέον, συγκρίναμε τις αλληλεπιδράσεις των D1/NMDA/AMPA υποδοχέων που παρατηρούνται στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό με αυτές που εμφανίζονται στο ραβδωτό σώμα, στο οποίο η πυκνότητα των D1 υποδοχέων είναι η μέγιστη στον εγκέφαλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων από τον ειδικό αγωνιστή τους SKF38393 (10 μΜ) στις τομές του ιππόκαμπου και του προμετωπιαίου φλοιού έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης: α) της σερίνης-897 της NR1 υπομονάδας και της σερίνης-1303 της NR2B υπομονάδας του NMDA υποδοχέα, οι οποίες επάγουν τη διακίνηση των υποδοχέων στην μεμβρανική επιφάνεια (trafficking) και την ενίσχυση των ρευμάτων του ιοντικού διαύλου, αντίστοιχα, β) των σερινών-831 και -845 της GLUR1 υπομονάδας του AMPA υποδοχέα, οι οποίες ενισχύουν τα ρεύματα του ιοντικού διαύλου και αυξάνουν την πιθανότητα ανοίγματος του καναλιού, αντίστοιχα και γ) της ERK1/2 κινάσης, αλλά όχι της DARPP-32. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η συνενεργοποίηση των D1 και NMDA υποδοχέων με ανενεργές δόσεις των ειδικών αγωνιστών τους SKF38393 (2 μΜ) και NMDA (5 μΜ), αντίστοιχα έχει ως αποτέλεσμα μια περαιτέρω αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων, καθώς και της ERK1/2 κινάσης, αλλά όχι της DARPP-32. Οι παραπάνω επαγόμενες από την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων και την συνενεργοποίηση των D1/NMDA υποδοχέων φωσφορυλιώσεις αναστέλλονται πλήρως από τον ειδικό αναστολέα της ενεργοποίησης της ERK1/2 κινάσης, SL327. Αντίθετα, στο ραβδωτό σώμα τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η επαγόμενη από τους D1 υποδοχείς φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων βασίζεται στο καλά περιγραμμένο σηματοδοτικό μονοπάτι D1/PKA/DARPP-32. Συμπερασματικά, τα «in vitro» πειράματα δείχνουν στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό να υφίσταται ισχυρή συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των D1 και των NMDA υποδοχέων, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΕΡΚ1/2 κινάσης. Επιπλέον, η επαγόμενη από την διέγερση των D1 υποδοχέων και από τη συνδιέγερση των D1/NMDA υποδοχέων φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMΡΑ υποδοχέων φαίνεται να οφείλεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της ERK1/2 κινάσης και πιθανώς αποτελεί το μοριακό υπόβαθρο της ενίσχυσης των ρευμάτων των NMDA και AMPA υποδοχέων από την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων. Προκειμένου να διερευνήσουμε εάν αυτή η συνεργιστική αλληλεπίδραση των D1/ NMDA υποδοχέων υφίσταται και «in vivo» και να εξετάσουμε περαιτέρω τη λειτουργική της σημασία, επιλέξαμε ένα φυσικό συμπεριφορικό τεστ, την εισαγωγή των πειραματόζωων σε «πρωτόγνωρο» περιβάλλον (ελεύθερη εξερεύνηση του χώρου). Η δοκιμασία αυτή είναι γνωστό ότι επάγει την αύξηση των επιπέδων ντοπαμίνης στον ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο φλοιό και κατ’ επέκταση επάγει την ενεργοποίηση των D1 υποδοχέων. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η εισαγωγή των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον επάγει στον ιππόκαμπο και στον προμετωπιαίο φλοιό: α) μια σημαντική αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης των υπομονάδων των NMDA και ΑΜPA υποδοχέων, καθώς και ισχυρή φωσφορυλίωση/ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης. Τα φαινόμενα αυτά όπως δείξαμε μετά τη χορήγηση ειδικών ανταγωνιστών εξαρτώνται από τη σύγχρονη ενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων και οφείλονται στο «νέο» ερεθίσματα, δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται μετά από δοκιμασία «εξοικείωσης» των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον, β) επιγεννετικές τροποποιήσεις (φωσφορυλίωση/ ακετυλίωση της ιστόνης Η3) και γ) αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης των πρώιμων γονιδίων cFos και zif268 επιλεκτικά στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου, φαινόμενα τα οποία εξαρτώνται από την συνενεργοποίηση των D1/ NMDA υποδοχέων, καθώς και των μουσκαρινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Συμπερασματικά τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι: α) η φωσφορυλίωση των υπομονάδων των NMDA και AMPA υποδοχέων πιθανώς δρα ως «δείκτης του πρωτόγνωρου ερεθίσματος», δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται μετά την «εξοικείωση» των επίμυων στο «καινούργιο» περιβάλλον, β) η ισχυρή ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού της ERK1/2 κινάσης που επάγεται από το «νέο» ερέθισμα απαιτεί τη συνεργιστική αλληλεπίδραση των D1/ NMDA υποδοχέων και γ) η ενεργοποίηση του μονοπατιού μεταγωγής σήματος της ERK1/2 κινάσης οδηγεί σε επιγεννετικές αλλαγές και αύξηση της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων cFos και zif268, φαινόμενα τα οποία απαιτούνται στη ρύθμιση της συναπτικής πλαστικότητας, καθώς και στις διαδικασίες της μνήμης και της μάθησης.