Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ενώσεων που προκαλούν ορμονικές διαταραχές με υγροχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών

Abstract

During the present PhD thesis analytical methods based on LC-MS and LC-MS/MS were developed for the determination of significant EDCs in food water and environmental samples. In the first experimental part an analytical method based on LC-ESI-MS molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) and microwave assisted extraction (MAE) was developed for the determination of BPA in milk, pineapple, tuna and mushrooms. The sample preparation for milk was simple and efficient comprising only dilution of milk and MISPE. The limit of detection was 0.2 ng g⁻¹. The sample preparation for pineapple, tuna and mushrooms comprised of MAE and MISPE. It was demonstrated that the combination of MAE with MISPE permits the use of a selective extraction solvent MeOH/water (4/6) simplifying the sample preparation steps. The method LODs were 0.9-1.4 ng g⁻¹. In the second part of this project a novel LC-ESI-MS method for the simultaneous determination of four of the most significant estrogenic compounds naturally occurring in beer zearalenone, α- and β-zearalenol and 8-prenylnaringenin was developed. A strategy for the development of a LC-MS method is proposed during which the effect of the polarity ionisation, and the composition of mobile phase were studied and experimental design was applied to assess the effects of the LC-ESI-MS parameters on the obtained signal. The proposed method is simple, consisting only of degassing the beer by magnetic stirring and diluting with water (1:1 v/v). The method limits of detection were 0.8 - 1.4 ng g⁻¹. In the third part a novel LC-MS/MS method for the simultaneous determination of two of the most significant booster biocides used in antifouling paints, irgarol 1051 and diuron and their degradation products, M1, 3,4-DCPMU, 3,4-DCPU and 3,4-DCA, was developed in sea water, mussel and sediment, by selected reaction monitoring. The ionisation of the analytes by ESI and APCI was studied in positive and negative mode using different mobile phases and special attention was drawn on the ionization of 3,4-DCA which presents difficulties in atmospheric pressure ionization techniques. Experimental design was applied for the optimization of the ESI and APCI parameters and an optimization strategy plan for the whole LC-API-MS/MS method is proposed. For sediments and mussels a direct and simple sample preparation is proposed, comprising only of solvent extraction. The method limits of detection ranged between 0.6 and 3.5 ng g⁻¹ for sediment and mussel and from 1.3 - 1.8 ng g⁻¹ for sea water. Finally a screening method was developed using the precursor ion scan and the neutral loss technique which was compared with the corresponding SRM method.

Στην παρούσα ερευνητική εργασία αναπτύχθηκαν LC-MS και LC-MS/MS μέθοδοι προσδιορισμού ενδοκρινικών και εν δυνάμει ενδοκρινικών διαταρακτών, ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, σε τρόφιμα, νερό και περιβάλλον. Κατά το πρώτο πειραματικό μέρος αναπτύχθηκε μέθοδος προσδιορισμού της δισφαινόλης Α σε γάλα, τόνο, μανιτάρια και ανανά με LC-ESI-MS και εκχύλιση στέρεας φάσης με πολυμερές μοριακής αποτύπωσης (MISPE) και εκχύλιση με φούρνο μικροκυμάτων (MAE). Η προετοιμασία των δειγμάτων γάλατος είναι απλή και αποτελείται μόνο από αρχική αραίωση του δείγματος και εκχύλιση με MISPE. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου είναι 0, 2 ng g⁻¹. Στα δείγματα τόνου, μανιταριών και ανανά εφαρμόστηκε εκχύλιση ΜΑΕ και MISPE. Ο συνδυασμός αυτών των τεχνικών επέτρεψε τη χρήση ενός εκλεκτικού εκχυλιστικού συστήματος MeOH/νερό (4/6), χωρίς την ανάγκη αλλαγής διαλύτη. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου ήταν 0,9 - 1,4 ng g⁻¹. Στο δεύτερο πειραματικό μέρος αναπτύχθηκε LC-ESI-MS μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τεσσάρων φυσικών οιστρογονικών ενώσεων που βρίσκονται στη μπύρα, της μυκοτοξίνης ζεαραλενόνης και των δύο μεταβολιτών της την α- και β-ζεαραλενόλη και του φυτοοιστρογόνου 8-πρενυλοναρινγενίνη. Στην εργασία αυτή προτείνεται συγκεκριμένη στρατηγική ανάπτυξης μεθόδου LC-MS κατά την οποία μελετήθηκε η επίδραση της πολικότητας του ιοντισμού και της σύστασης της κινητής φάσης και βελτιστοποιήθηκαν οι παράμετροι LC-ESI-MS με εφαρμογή πειραματικού σχεδιασμού. Η προετοιμασία των δειγμάτων ήταν απλή και σύντομη και περιλάμβανε απαέρωση της μπύρας και αραίωση με νερό. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου ήταν 0,8-1,4 ng mL⁻¹. Στο τρίτο πειραματικό μέρος της διατριβής αναπτύχθηκε μέθοδος προσδιορισμού δύο από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες βιοκτόνες ουσίες των υφαλοχρωμάτων irgarol 1051 και diuron και των προϊόντων αποικοδόμησης τους Μ1, 3,4-DCPMU, 3,4-DCPU και 3,4-DCA, σε θαλασσινό νερό, μύδια και ίζημα, με LC-MS/MS και παρακολούθηση επιλεγμένων μεταπτώσεων. Στην εργασία αυτή προτείνεται μια στρατηγική ανάπτυξης μεθόδου LC-MS/MS κατά την οποία μελετήθηκε ο ιοντισμός των προαναφερόμενων ουσιών με ESI και με APCI, σε θετική και αρνητική πολικότητα υπό διαφορετικές κινητές φάσεις και έγινε χρήση πειραματικού σχεδιασμού. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στη DCA η οποία παρουσιάζει δυσκολίες κατά τον ιοντισμό της με τεχνικές ατμοσφαιρικής πίεσης. Για τα ιζήματα και τα μύδια, προτείνεται μια άμεση και απλή διαδικασία προετοιμασίας δειγμάτων η οποία περιλαμβάνει μόνο απλή εκχύλιση με διαλύτη. Τα όρια ανίχνευσης για το θαλασσινό νερό κυμαίνονταν μεταξύ 1,3 ng g⁻¹ - 1,8 ng g⁻¹, και για το θαλασσινό ίζημα και τα μύδια μεταξύ 0,6 ng g⁻¹ - 3,5 ng g⁻¹. Τέλος, αναπτύχθηκε μια μέθοδος διαλογής (screening) με την τεχνική σάρωσης πρόδρομου ιόντος και ανίχνευσης απώλειας ουδέτερου μορίου.