Αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών απορριμμάτων για παραγωγή βιοκαταλυτών για συνεχή ερυθρά οινοποίηση σε χαμηλές θερμοκρασίες και μηλογαλακτική ζύμωση των οίνων

Abstract

The main interest of this thesis is the utilization of agro-industrial wastes for production of biocatalysts for red wine making at low temperatures and the malolactic fermentation of wine. In the first part of the thesis the biotechnological processes concerning wine making, such as alcoholic fermentation, red wine making and malolactic fermentation, were reviewed. All new technological aspects and new techniques in wine making over the last 30 years were presented.In the second part, agro-industrial wastes were examined as potential biocatalysts for immobilization of appropriate microorganisms and were used for wine making. Delignified cellulosic material (DCM) from cereals were used, since it is the most common agro-industrial waste and have already been used for immobilization of yeast for wine making. DCM was examined as potential substrate for lactic acid bacteria immobilization for malolactic fermentation. Two common lactic acid bacteria were used, Lactobacillus casei ATCC393 and Oenococcus oeni ATCC23279 with very promising results. Biocatalyst with L. casei reached the malic acid conversion up to 80 % with 30 days operation stability, while biocatalyst with O. oeni reached 67 % malic acid conversion. Lactic acid concentration in both biocatalysts remained at low levels. High content of lactic acid in wine does not contribute positively to wine aroma, since lactic acid contributes to volatile acidity and is also used as an indicator of wine spoilage. Both biocatalysts gave good results, thus L. casei was used subsequently for the malolactic fermentation. Only in the co-culture experiments in continuous systems, O. oeni was used for comparative reasons. Biocatalyst of L. casei immobilized on DCM was examined for the malolactic activity in a range of temperatures. Results gave high operation stability with high malic acid degradation that reached 49 % at 20 oC. Also the same biocatalyst was used for continuous malolactic fermentation with conversion of malic acid reaching 60% with 24 days operation stability. Immobilization of L. casei in sawdust was examined as well with less acceptable results. In the third part, DCM was examined as a substrate for co-culture immobilization of S. cerevisiae and L. casei for both alcoholic and malolactic fermentation in wine making. Two different immobilization techniques were examined. In the first, immobilization in sequence of each microorganism was performed using the same amount of DCM, while in the second immobilization of each microorganism was achieved in separately but equal amounts of DCM and then were mixed before fermentations. Both methods gave good results while the 2nd immobilization technique was used in subsequent experiments since biocatalyst production was easier. In the batch bioreactor, malic acid conversion reached levels of about 57.5 % with 1.9 g/L/h ethanol productivity, while in the continuous system 18.5% and 2.0 g/L/h, respectively. Co-culture with S. cerevisiae and O. oeni immobilized on DCM was also used in the continuous system exhibiting 54.3% malic acid conversion and 2.17 g/L/h ethanol productivity.At the fourth part of the thesis, red wine making in a continuous system was examined. Two different systems of bioreactors were used. The first system consisted of one bioreactor, while the second system consisted of two separate bioreactors. Both systems gave positive results in the final product, but the system with two bioreactors was preferred, due to easier handling and low possibility of biocatalysts infection. The second system was also used with DCM immobilized with co-culture of S. cerevisiae and L. casei compromising 48.6% malic acid conversion and organoleptic characteristics of wine similar to commercial wines. All the above results were used for scale-up bioreactor design. A 10 L system of two bioreactors was constructed with 1.5 L red wine production per day. The final product had characteristics similar to commercial wines.In conclusion, agroindustrial cellulosic material can be used for production of immobilized biocatalysts that are capable (i) for both alcoholic and malolactic fermentation, (ii) continuous red wine making and (iii) applications in malic acid degradation of must up to 30%.

Η διατριβή αυτή έχει ως κύριο στόχο την αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών απορριμμάτων για παραγωγή βιοκαταλυτών για συνεχή ερυθρά οινοποίηση σε χαμηλές θερμοκρασίες και μηλογαλακτική ζύμωση των οίνων. Στο πρώτο μέρος γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση της μέχρι σήμερα γνώσης στην παραγωγή οίνου και κυρίως την αλκοολική ζύμωση, τη μηλογαλακτική ζύμωση και την ερυθρά οινοποίηση. Εξετάζονται τυχόν καινοτόμες μέθοδοι παραγωγής οίνου καθώς και οι τεχνικές βελτιστοποίησης του τελικού προϊόντος στα τελευταία 30 χρόνια.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής μελετάται κατά πόσο είναι δυνατόν να γίνει χρήση αγροτοβιομηχανικών απορριμμάτων για την δημιουργία υποστρωμάτων κατάλληλων για ακινητοποίηση και χρήση τους σαν βιοκαταλύτες για την παραγωγή οίνου. Για τον σκοπό αυτό εξετάστηκαν τα απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά ως το πιο διαδεδομένο απόρριμμα της παραγωγής δημητριακών. Η ικανότητα του συγκεκριμένου υλικού ως προς την ακινητοποίηση ζυμών για την παραγωγή οίνου ήταν αντικείμενο προηγούμενων μελετών, με πολύ θετικά αποτελέσματα. Το υπόστρωμα εξετάστηκε ως προς την ικανότητα ακινητοποίησης γαλακτικών βακτηρίων που είναι κατάλληλα για μηλογαλακτική ζύμωση. Χρησιμοποιήθηκαν τα δύο πιο προσιτά βακτήρια της μηλογαλακτικής ζύμωσης του οίνου, όπως είναι το Lactobacillus casei ATCC393 και το Oenococcus oeni ATCC23279, με τα αποτελέσματα και στις δύο περιπτώσεις να είναι θετικά. Για τον L. casei η μετατροπή του μηλικού οξέος στον οίνο έφτασε έως και το 80 % με λειτουργική σταθερότητα έως ένα μήνα. Για τον O. oeni η μετατροπή του μηλικού οξέος έφτασε έως το 67 %, ενώ η λειτουργική σταθερότητα, πλησίασε τον ένα μήνα. Και στις δύο περιπτώσεις η παραγωγή γαλακτικού οξέος από το μηλικό δεν ήταν στοιχειομετρική. Το αποτέλεσμα αυτό κρίθηκε θετικό αφού η αύξηση του γαλακτικού οξέος προκαλεί αύξηση της πτητικής οξύτητας του τελικού οίνου που δεν είναι επιθυμητό φαινόμενο. Και οι δύο μικροοργανισμοί έδωσαν αποτελέσματα που δεν είχαν σημαντικές διαφορές και για το λόγο αυτό στην έρευνα που ακολούθησε χρησιμοποιήθηκε εκείνος που δεν δημιουργεί προβλήματα στο χειρισμό. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν για τα υπόλοιπα πειράματα μηλογαλακτικής ζύμωσης του οίνου κύτταρα L. casei, ενώ χρησιμοποιήθηκε ο O. oeni στα τελικά πειράματα με συγκαλλιέργεια για σύγκριση των τελικών αποτελεσμάτων.Τα ακινητοποιημένα κύτταρα σε απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά μελετήθηκαν ως βιοκαταλύτης συναρτήσει της θερμοκρασίας. Και σε αυτή την περίπτωση παρουσιάστηκαν υψηλές μετατροπές του μηλικού οξέος στον οίνο, με καλύτερα αποτελέσματα στους 20 oC, όπου η μετατροπή έφτασε το 49.1%. Ο βιοκαταλύτης μελετήθηκε και σε σύστημα συνεχούς λειτουργίας, όπου λειτούργησε για 24 ημέρες με μείωση του μηλικού έως και 60.4%. Τέλος μελετήθηκαν κυτταρινούχα υλικά χωρίς απολιγνινοποίηση σε συστήματα διαλείποντος έργου και συνεχούς λειτουργίας, για την δυνατότητα ακινητοποίησης γαλακτικών βακτηρίων. Τα αποτελέσματα δεν ήταν ικανοποιητικά συγκριτικά με τα απολιγνινοποιημένα.Στο επόμενο στάδιο εξετάστηκε η δυνατότητα συγκαλλιέργειας ζυμών και βακτηρίων για ταυτόχρονη αλκοολική και μηλογαλακτική ζύμωση του οίνου. Μελετήθηκαν δύο τρόποι ακινητοποίησης και παραγωγής του βιοκαταλύτη, ενώ η βέλτιστη μέθοδος εφαρμόστηκε και σε σύστημα συνεχούς λειτουργίας, καθώς και με κύτταρα O. oeni ως κύριο βακτήριο για τη μηλογαλακτική ζύμωση. Τα αποτελέσματα ήταν θετικά, καθώς παρουσιάστηκαν μειώσεις του μηλικού οξέος έως 57.5% για το σύστημα διαλείποντος έργου και μείωση 18.5% για το συνεχές σύστημα, με ταυτόχρονη μεγάλη παραγωγικότητα σε αιθανόλη 1.9 και 2.0 g/L/h αντίστοιχα, ενώ το συνεχές σύστημα με κύτταρα O. oeni ως κύριο βακτήριο παρουσίασε μείωση του μηλικού έως 54.3% και παραγωγικότητα αιθανόλης 2.2 g/L/h.Στο τελικό στάδιο της διατριβής έγινε ανάπτυξη και μελέτη ενός συστήματος συνεχούς λειτουργίας για την παραγωγή ερυθρού οίνου σε χαμηλές θερμοκρασίες. Μελετήθηκαν δύο συστήματα του ενός και των δύο αντιδραστήρων. Τα αποτελέσματα ήταν όμοια και στα δύο συστήματα όμως η ευκολία χειρισμού καθώς και η μείωση της πιθανότητας μόλυνσης του βιοκαταλύτη καθόρισαν ως πιο επιτυχημένο το σύστημα με τους δύο βιοαντιδραστήρες. Χρησιμοποιώντας το σύστημα αυτό, μελετήθηκε η χρήση συγκαλλιέργειας για την πραγματοποίηση των επιθυμητών διεργασιών του γλεύκους. Τα αποτελέσματα κρίθηκαν ικανοποιητικά με τη μείωση του μηλικού να φτάνει τα 48.6%, το ερυθρό χρώμα του οίνου να πλησιάζει εκείνο των εμπορικών οίνων και την παραγωγικότητας της αιθανόλης σε υψηλά επίπεδα.Τα παραπάνω αποτελέσματα συνέβαλαν στην δημιουργία ενός συστήματος ερυθράς οινοποίησης σε χαμηλές θερμοκρασίες και με αυξημένη κλίμακα pilot plant. Αναλυτικότερα, το σύστημα είχε συνολικό όγκο 10 L και παρήγαγε 1.0 με 1.5 L ερυθρού οίνου ημερησίως, με χρώμα παραπλήσιο με αντίστοιχα εμπορικά προϊόντα. Σε όλα τα παραπάνω πειράματα εξετάστηκαν η χημική σύσταση και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων. Σαν γενικό συμπέρασμα προκύπτει ότι τα αγροτικά κυτταρινούχα απορρίμματα μπορούν να αξιοποιηθούν για την παραγωγή ακινητοποιημένων βιοκαταλυτών κατάλληλων για (i) συνεχή ταυτόχρονη αλκοολική και μηλογαλακτική ζύμωση καθώς και (ii) συνεχή ερυθρά οινοποίηση. (iii) Επίσης οι βιοκαταλύτες αυτοί μπορεί να έχουν εφαρμογή στη μείωση της οξύτητας γλεύκους και την ταυτόχρονη ζύμωση των γλευκών, εφόσον εκεί απαιτειται μείωση του μηλικού λιγότερο από 30%.