Ανίχνευση μεταλλαγών με τη μέθοδο των γενετικών αλληλουχιών στον Α - αντιγονικό καθοριστή (επίτοπο) του γονιδίου S του ιού της ηπατίτιδας Β σε χρόνιους φορείς στην Ελλάδα

Abstract

Virological data on chronic hepatitis B virus (HBV) infection in Greece are limited. The aim of this study was to investigate the HBV genotypes, surface antigen (HBsAg) subtypes, and HBsAg ‘‘a’’ determinant mutations among patients infected chronically with HBV. Serum samples from 135 HBsAg positive patients were tested. Serologic (HBsAg, anti-HBs, anti-HBc (total), anti-HBc IgM, HBeAg, and anti-HBe), virologic (HBV-DNA quantitation) and biochemical markers (serum alanine aminotransferase/ALT and aspartate aminotransferase/ AST) were analyzed. HBV genotypes and HBsAg subtypes were determined by partial sequencing of the S gene. Genotyping was performed by using the National Center for Biotechnology Information online Genotyping tool and phylogenetic analysis. Nucleotide sequences were aligned pair wise with ClustalW and phylogenetic trees were constructed by the neighbor-joining method. Sequences were also used to predict HBV HBsAg subtypes. In six patients (4%), simultaneous presence of HBsAg and anti-HBs was determined, whereas 47 patients (35%) were HBeAg positive, 84 (62.5%) were anti-HBe positive, and three patients (2,2%) were characterized by the simultaneous presence of HBeAg and anti-HBe. Mean ALT was 238 IU/L (standard deviation=576.84), and HBV-DNA levels ranged from 1,01 x 10⁵ to 1,2 x 10⁷ IU/ml. Genotype D was predominant (98%), with viral groups D/ ayw2 (73%) and D/ayw3 (27%). Group A/adw accounted for 0,7% of cases. Genotypes B and C were found exclusively in the Chinese immigrants (1,4%). Single or multiple point mutations were found in 35 cases (26%). Some of the most common mutations occurred at amino acid positions 129, 133, 134, 144, 145, including the ‘‘vaccine escape’’ mutation G145R. Mutations analysis revealed that amino acid substitutions did not affect detection by commercial immunoassays, except for one case.

Τα δεδομένα μοριακής επιδημιολογίας για την ηπατίτιδα Β που αφορούν τον Ελληνικό πληθυσμό είναι περιορισμένα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των γονοτύπων, των υποτύπων του επιφανειακού αντιγόνου HBsAg και των μεταλλαγών στον α-αντιγονικό καθοριστή του επιφανειακού αντιγόνου σε χρόνιους φορείς της ηπατίτιδας Β. Εξετάσθηκαν οι οροί αίματος 135 φορέων θετικών για το επιφανειακό αντιγόνο. Προσδιορίστηκαν οι ορολογικοί δείκτες (HBsAg, antiHBs, anti-HBc (ολικό), anti-HBc IgM, HBeAg και anti-HBe) το ιικό φορτίο (HBVDNA ποσοτικός προσδιορισμός) και οι βιοχημικοί δείκτες (αλανινοαμινοτρασφεράση/ALT και ασπαρτική αμινοτρασφεράση/ AST) στον ορό των παραπάνω ασθενών. Από την ανάλυση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων τμήματος του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη S προσδιορίστηκαν οι γονότυποι των HBV στελεχών των παραπάνω ασθενών όπως και οι HBsAg υπότυποι. Η γονοτυπική ανάλυση έγινε με τη χρήση του γονοτυπικού εργαλείου (Genotyping tool) που είναι ελεύθερα διαθέσιμο στην ιστοσελίδα της Εθνικής Βιβλιοθήκης του Εθνικού Κέντρου για την Βιοτεχνολογική Πληροφόρηση των Η.Π.Α. (NCBI) και με φυλογενετική ανάλυση. Έγινε ανά ζεύγος σύγκριση των αλληλουχιών με αντίστοιχες αλληλουχίες στελεχών αναφοράς του ίδιου γονοτύπου με τη βοήθεια του λογισμικού ClustalW ενώ ο σχεδιασμός των φυλογενετικών δέντρων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο neighbor-joining. Η ανάλυση των αλληλουχιών χρησιμοποιήθηκε επίσης και για τον προσδιορισμό των HBsAg υποτύπων. Σε έξι ασθενείς (4%) ανιχνεύθηκαν συγχρόνως τόσο το HBsAg όσο και το anti-HBs αντίσωμα, ενώ 47 ασθενείς (35%) ήταν HBeAg θετικοί, 84 (62,5%) ήταν θετικοί για anti-HBe αντίσωμα ενώ σε 3 ασθενείς (2,2%) υπήρχε ταυτόχρονη παρουσία του HBeAg και του anti-HBe. Η μέση τιμή της ALT ήταν 238IU/L με SD=576,84 και τα επίπεδα του ιικού φορτίου κυμάνθηκαν στα 1,01 x 10⁵ έως 1,2 x 10⁷ IU/ml. Ο γονότυπος D ήταν ο κυρίαρχος (98%) με τον υπότυπο D/ayw2 να φθάνει το 73% και τον D/ayw3 το 27%. Ο γονότυπος A με υπότυπο adw αφορούσε το 0,7%. Οι γονότυποι B και C βρέθηκαν αποκλειστικά σε μετανάστες από την Κίνα στο 1,4%. Απλές ή πολλαπλές σημειακές μεταλλαγές βρέθηκαν σε 35 ασθενείς (26%). Μερικές από τις πιο συχνές μεταλλαγές ήταν στις θέσεις αμινοξέων 129, 133, 134, 144 και 145, συμπεριλαμβανομένης και της μεταλλαγής διαφυγής του εμβολίου G145R. Από την ανάλυση των μεταλλαγών φάνηκε ότι οι υποκαταστάσεις αμινοξέων στις διάφορες θέσεις του α-αντιγονικού καθοριστή δεν επηρέασαν τη δυνατότητα ανίχνευσης του επιφανειακού αντιγόνου HBsAg από όλα τα στελέχη πλην ενός.