Μελέτη του ρόλου των υποδοχέων φυσικής ανοσίας (Mannose receptors, Toll-like receptors) στην αλληλεπίδραση της P. aeruginosa με ανθρώπινα μονοκύτταρα

Abstract

The opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa is a multi-drug resistant organism that causes devastating infections in patients with immunosupression, severe burns or cystic fibrosis. Inflammatory cytokines, produced mainly by macrophages, play a major role in the pathogenesis of these infections. Many gene products of the bacterium, like LPS, Exotoxin-A and Exoenzyme-S, stimulate with different potency cytokine production and contribute to the pathophysiology of Pseudomonas infection. Slime-Glycolipoprotein, an extracellular product produced during in vivo infection stimulates TNF-α production with equal potency of viable bacteria and activates NF-κΒ and AP-1 transcription factors. Understanding how P. aeruginosa interacts with macrophages to stimulate proinflammatory cytokine production is important for a more complete comprehension of its pathogenesis. The immune system has evolved receptors, called PRRs that recognize specific molecules (PAMPs) present on pathogenic organisms but show limit interaction with host components. These receptors include the Toll-Like Receptor family, endocytic receptors like Mannose receptor and scavenger receptors. Which PRRs are engaged and in what combination will dictate the overall response. The aim of our study was to delineate the mechanisms of P. aeruginosa interaction with specific PRRs on macrophages, which leads to NF-κΒ activation and proinflammatory cytokine production. Therefore, we specially focused on TLR2, TLR4 and Mannose receptor. TLR2 and TLR4 are well studied signaling receptors that activate NF-κΒ after binding to specific PAMPs. We studied TLR4 since P. aeruginosa has LPS, TLR2 since P. aeruginosa has an extracellular glycolipid component and mannose receptor since data from our previous work have shown that slime-GLP, and the glycolipid component of Pseudomonas is rich in mannose, whereas P. aeruginosa LPS contains just detectable amounts of the same sugar. Mannose receptor is an endocytic, but not professional phagocytic receptor that has been involved in recognition of Candida albicans, Pneumocystis carinii, Leissmania donovani, Mycobacterium tuberculosis, Klebsiella pneumoniae. Mannose receptor is a phagocytic receptor for non opsonised P. aeruginosa strains. To address the questions of our study we used fresh human monocytes, which we challenged with viable clinical non mucoid, P. aeruginosa strains, purified LPS or GLP in the presence or absence of specific blocking antibodies against TLR4, TLR2 or mannose receptor. Proinflammatory cytokine production was measured as index of monocyte activation. P. aeruginosa LPS stimulates TNF-α production, Slime-GLP is a much stronger stimulant and viable bacteria cause a comparable to GLP TNF-α production. Blocking of TLR4 inhibited P. aeruginosa induced TNF-α production by 30%, whereas blocking of TLR2 or mannose receptor drastically inhibited TNF-α production in a dose dependent manner. Simultaneous blocking of both TLR2 and mannose receptor almost abolished TNF-α production. We examined if TNF-α production is linked to phagocytosis by adding cytochalasin which inhibits phagocytosis by inhibiting actin polymerization. We got the same inhibition of TNF-α production as with anti-mannose receptor. We examined the role of mannose receptor as signaling receptor by transfecting HEK cells, which do not express mannose receptor, with NF-κΒ reporter plasmid along with plasmid DNA which encodes the mannose receptor expression. HEK cells were challenged with viable bacteria or slime-GLP. Both slime GLP and viable bacteria activate NF-κΒ by 6-10 folds, whereas LPS could not activate NF-κΒ through MR. TLR2 and mannose receptor family members’ cooperation has been proven as mechanism of activation of macrophages by mycobacteria and fungi. To examine a possible cooperation with TLR2, we co-expressed on the same cells TLR2 and mannose receptor along with NF-κΒ reporter plasmid. NF-κΒ activation is higher in the presence of both receptors than TLR2 alone, when cells are stimulated either with Slime-GLP or viable bacteria. To further substantiate the signaling function of mannose receptor for P. aeruginosa, we checked by immunoblot MAP kinase family activation in HEK cells expressing only TLR2 or both TLR2 and Mannose receptor. Either GLP or viable bacteria cause a slight activation of p38 and erk kinases in cells expressing only TLR2, but this effect is much stronger when mannose receptor is present. To investigate TLR2 and Mannose receptor cooperation in vivo, macrophages were checked by confocal microscopy, for the expression and function of both receptors during infection with P. aeruginosa viable bacteria. Both receptors are present on the cell surface of unchallenged cells, but 60 minutes after the infection both receptors co-localize to subcellular formulation along with the phagocytosed bacterium. Our results identify for the first time that mannose receptor is a signaling receptor for P. aeruginosa and is involved in MAP kinase activation, NF-κΒ activation and TNF-α production by human monocytes the first sensors of infection. Our data suggest that slime-GLP is the main activator of mannose receptor function. Previous studies in our lab have shown that P. aeruginosa slime-GLP activates MAP kinase family members through TLR2. Additionally according to our data, TLR2 a well known signaling receptor for P. aeruginosa, synergizes with mannose receptor for maximum NF-κΒ activation. TLR4 has a small contribution to TNF-α production. These findings provide new insights for future development of new immunotherapies for P. aeruginosa mediated sepsis.

Το ευκαιριακό παθογόνο βακτήριο Pseudomonas aeruginosa είναι ένας πολυανθεκτικός μικροοργανισμός στα αντιβιοτικά, που προκαλεί σοβαρές λοιμώξεις σε ασθενείς με ανοσολογικά ελλείμματα, με σοβαρά εγκαύματα, κυστική ίνωση ή σε ασθενείς που νοσηλεύονται σε μονάδες εντατικής θεραπείας. Οι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες που παράγονται κυρίως από τα μακροφάγα, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση αυτών των λοιμώξεων. Πολλά προϊόντα γονιδίων του βακτηρίου, όπως ο LPS, η Exotoxin-A και το Exoenzyme-S, διεγείρουν με διαφορετική δύναμη την παραγωγή κυτταροκινών και συμβάλλουν στην παθοφυσιολογία των λοιμώξεων από Ψευδομονάδα. Η κατανόηση του πώς η P. aeruginosa διαντιδρά με τα μακροφάγα για να διεγείρει την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών είναι απαραίτητη για να καταλάβουμε καλύτερα την παθογένεια της λοίμωξης από την P. aeruginosa. Το ανοσολογικό σύστημα έχει αναπτύξει υποδοχείς, τους PRRs, που αναγνωρίζουν ειδικά μόρια που καλούνται PAMPs, τα οποία είναι παρόντα στους παθογόνους μικροοργανισμούς, αλλά διαντιδρούν ελάχιστα με τα συστατικά του ξενιστή. Οι PRRs περιλαμβάνουν την οικογένεια των Toll-Like Receptors, υποδοχείς που κάνουν ενδοκυττάρωση όπως ο υποδοχέας μαννόζης και scavenger receptors. Ποιοι PRRs εμπλέκονται και με ποιο συνδυασμό θα ορίσει τη συνολική απόκριση. Σκοπός της μελέτης μας ήταν να αποσαφηνισθούν οι μηχανισμοί με τους οποίους η P. aeruginosa διαντιδρά με ειδικούς PRRs των μακροφάγων, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση του NF-κΒ και την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Μελετήσαμε τον TLR4 αφού η P. aeruginosa έχει LPS, τον TLR2 αφού η P. aeruginosa έχει ένα εξωκυττάριο γλυκολιπιδικό συστατικό και τον υποδοχέα μαννόζης αφού προηγούμενα δεδομένα έχουν δείξει ότι το slime-GLP, το γλυκολιπιδικό συστατικό της Pseudomonas είναι πλούσιο σε μαννόζη, ενώ ο LPS της περιέχει μόλις ανιχνεύσιμα ποσά από το ίδιο σάκχαρο. Ο υποδοχέας μαννόζης είναι υποδοχέας που κάνει ενδοκυττάρωση, όχι όμως φαγοκυττάρωση, και έχει εμπλακεί στην αναγνώριση των Candida albicans, Pneumocystis carinii, Leissmania donovani, Mycobacterium tuberculosis, Klebsiella pneumoniae, ενώ είναι φαγοκυτταρικός υποδοχέας για μη οψωνινοποιημένα στελέχη της P. aeruginosa. Για να απαντήσουμε στα παραπάνω ερωτήματα χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινα μονοκύτταρα από υγιείς δότες, τα οποία διεγείραμε με ζωντανά κλινικά μη βλεννώδη στελέχη της P. aeruginosa, κεκαθαρμένο LPS ή GLP παρουσία ή απουσία ειδικών ανασταλτικών της δράσης αντισωμάτων έναντι των TLR4, TLR2 ή του υποδοχέα μαννόζης. Ως δείκτης ενεργοποίησης των μακροφάγων μετρήθηκε η παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Ο LPS της P. aeruginosa διεγείρει την παραγωγή TNF-α , το Slime-GLP είναι πιο ισχυρός διεγέρτης και τα ζωντανά βακτήρια προκαλούν συγκρίσιμη με το GLP παραγωγή TNF-α. Η αναστολή της δράσης του TLR4 αναστέλλει την παραγωγή του TNF-α κατά 30%, ενώ η αντίστοιχη του TLR2 κατά 85%. Η αναστολή του υποδοχέα μαννόζης στις ίδιες πειραματικές συνθήκες, αναστέλλει την παραγωγή TNF-α δραστικά και με δοσοεξαρτώμενο τρόπο ενώ η ταυτόχρονη αναστολή της δράσης και των δύο υποδοχέων έχει ως αποτέλεσμα την τελεία αναστολή. Εξετάσαμε το ενδεχόμενο αν η παραγωγή TNF-α συνδέεται με τη φαγοκυττάρωση με τη κυττοχαλασίνης, η οποία αναστέλλει τον πολυμερισμό της ακτίνης και επομένως και τη φαγοκυττάρωση. Η αναστολή της παραγωγής TNF-α είναι συγκρίσιμη με αυτή που προκαλεί η αναστολή της δράσης του υποδοχέα της μαννόζης. Επομένως, η φαγοκυττάρωση συνδέεται με την παραγωγή TNF-α και ο υποδοχέας της μαννόζης φαίνεται να είναι ο κύριος φαγοκυτταρικός υποδοχέας. Για να ερευνήσουμε το ρόλο του υποδοχέα μαννόζης ως σηματοδοτικού υποδοχέα, μετασχηματίσαμε HEK κύτταρα, τα οποία δεν εκφράζουν τον υποδοχέα μαννόζης, με NF-κΒ reporter πλασμίδιο και με πλασμιδιακό DNA που κωδικοποιεί την έκφραση του υποδοχέα μαννόζης. Τα κύτταρα HEK διεγέρθηκαν είτε με ζωντανά βακτήρια είτε με slime-GLP και τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι τόσο το slime GLP όσο και τα ζωντανά βακτήρια ενεργοποιούν τον NF-κΒ 6-10 φορές, ενώ ο LPS P. aeruginosa δεν μπορεί να ενεργοποιήσει τον NF-κΒ μέσω του MR. Η συνεργασία των μελών των οικογενειών των TLR2 και του mannose receptor έχει αποδεχθεί ως μηχανισμός ενεργοποίησης των μακροφάγων από μυκοβακτηρίδια και μύκητες. Για να εξετάσουμε μία πιθανή συνεργασία με τον TLR2, συνεκφράσαμε στα ίδια κύτταρα τον TLR2 και τον υποδοχέα μαννόζης μαζί με NF-κΒ reporter πλασμίδιο. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ που παρατηρήθηκε είναι μεγαλύτερη παρουσία και των δύο υποδοχέων σε σύγκριση με τον TLR2 μόνο του, όταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν ή με Slime-GLP ή με ζωντανά βακτήρια. Για να επιβεβαιωθεί η λειτουργία της μεταβίβασης σήματος από τον mannose receptor για την P. aeruginosa, ελέγξαμε με immunoblot την ενεργοποίηση των μελών της οικογένειας των MAP κινασών σε κύτταρα HEK που εκφράζουν μόνο τον TLR2 ή και τους δύο, και τον TLR2 και τον Mannose receptor. Τόσο το GLP και τα ζωντανά βακτήρια προκαλούν μικρή ενεργοποίηση των p38 and Εrk κινασών σε κύτταρα που εκφράζουν μόνο τον TLR2, αλλά αυτό το αποτέλεσμα είναι πολύ πιο ισχυρό όταν είναι παρών ο υποδοχέας μαννόζης. Για την περαιτέρω διερεύνηση της συνεργασίας των δύο υποδοχέων, ελέγχθηκε με confocal microscopy η συμμετοχή των TLR2 και υποδοχέα μαννόζης στη φαγοκυττάρωση των ζωντανών βακτηρίων της P. aeruginosa. Τα πειράματα παρατήρησης με το συνεστιακό μικροσκόπιο καταδεικνύουν ότι και οι δύο υποδοχείς εκφράζονται στην επιφάνεια των μακροφάγων σε κύτταρα μη διεγερμένα. Μετά τα 45 λεπτά από τη διέγερση το μακροφάγο εγκολπώνει το βακτηριακό κύτταρο, ενώ μετά από 60 λεπτά από τη διέγερση και οι δύο υποδοχείς από την επιφάνεια του κυττάρου έχουν μετατοπισθεί και συνεντοπίζονται σε υποκυττάριο σχηματισμό μαζί με το ενδοκυτταρωμένο βακτήριο. Οι δύο υποδοχείς ακολουθούν την ίδια πορεία και εντόπιση κατά τη χρονική εξέλιξη της διέγερσης. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι ο mannose receptor είναι υποδοχέας μεταβίβασης σήματος για την P. aeruginosa και εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των MAP κινασών, την ενεργοποίηση του NF-κΒ και την παραγωγή TNF-α από ανθρώπινα μονοκύτταρα, τους πρώτους αισθητήρες της λοίμωξης. Τα δεδομένα μας επιπλέον καταδεικνύουν ότι το slime-GLP είναι ο κύριος ενεργοποιητής της λειτουργίας του υποδοχέα μαννόζης. Ο TLR2, γνωστός υποδοχέας μεταβίβασης σήματος για την P. aeruginosa, συνεργάζεται με τον υποδοχέα μαννόζης προς μέγιστη ενεργοποίηση του NF-κΒ ενώ ο TLR4 συμβάλλει ελάχιστα τόσο στην παραγωγή TNF-α όσο και την ενεργοποίηση του NF-κΒ. Τα ευρήματα μας προσδίδουν προοπτικές για μελλοντική ανάπτυξη νέων ανοσοθεραπειών για τη σήψη από P. aeruginosa.