Αλληλεπιδράσεις των συστημάτων νευροδιαβίβασης ντοπαμίνης/αδενοσίνης στον εγκέφαλο των "weaver" μυών, γενετικού μοντέλου ντοπαμινεργικής απονεύρωσης

Abstract

The present work studied the antagonistic interaction of A1/D1 receptors at the level of mRNA expression of the immediate early gene zif/268 (used as a marker of neuronal function). In parallel we studied the in vivo signal transduction of A1 and A2A adenosine receptors under dopamine deficiency in weaver mutant. The weaver mutant represents the only genetic animal model of gradual nigrostriatal neuron degeneration which can be characterized as a pathophysiological phenocopy of Parkinson s disease. In the first part of the study the co-activation of A1 and D1 receptors revealed the well-known antagonistic interaction of these receptors (possibly through the formation of A1/D1 heterodimer) in weaver mutant. An interesting result was that the activation of A1 receptors alone did induce zif/268 mRNA expression in striatal and specific cortical neurons in weaver mutant. This induction was not expected since A1 receptors are Gi coupled and suppress the signal transduction pathway that leads to zif/268 induction through AC/PKA/p DARPP 32/pCREB cascade. Further study revealed that the A1 receptor induced zif/268 mRNA expression iscounteracted by the A2A receptor selective antagonist ZM241385 and by the D2 receptor selective agonist Quinpirole suggesting the activation of A2A receptors and thus the activation of the indirect pathway. Moreover A1 receptors activation induced the expression of enkephalin mRNA but not of dynorphin which are considered as marker of neuronal activation of the indirect and the direct pathway respectively. The fact that the A1 receptor agonist did not induced zif/268 mRNA expression in +/+ animals indicates that under dopamine deficiency the A2A receptors react with a supersensitive response. This response was analyzed in weaver mouse after in vivo A2A receptor activation a) by examining the classical signal transduction pathway of A2A receptors/AC/PKA/p DARPP 32/pCREB which leads to zif/268 expression and b) by studying the MAPK cascade. Results showed increased basal phosphorylation levels of DARPP 32 (dopamine and cAMP regulated phosphoprotein MW 32kDa) of Thr 34 in weaver compared to control mice. Increased phosphoThr34 DARPP 32 would amplify the effects of the PKA and thus facilitating the signal transduction through A2A receptors/AC/PKA/p DARPP 32/pCREB. Therefore the A2A receptors supersensitive response under dopamine deficiency in weaver mutant seems to be due to elevated endogenous phosphorylation levels of DARPP 32. Interestingly while the basal phosphorylation levels of ERK1/2 (MAPK44/42) are elevated in weaver mutant they are significantly reduced after A2A receptor activation. Although we do not know the mechanism through which the endogenous ERK1/2 levels are elevated the conclusion is that under dopamine deficiency A2A receptors do not activate MAPK cascade. The present in vivo study demonstrates the role of A1 and A2A adenosine receptors in the function of basal ganglia under dopamine deficiency. Our results are significant since the experiments were performed in a genetic parkinsonian model in which the dopaminergic neurons are gradually degenerated and thus simulate the human PD and not in an acute toxic model. Moreover these results could be of possible clinical relevance since the activation of A1 receptors by endogenous adenosine would exaggerate the motor dysfunctions of PD. Furthermore the enhanced signal transduction pathway through A2A receptors supports the suggestion that the A2A receptor antagonists as antiparkinsonian agents. Given the well-known A2A/D2 antagonistic interaction new therapeutical prospectives would involve the development of pharmacological bivalent ligands which can interact with the A2A/D2 receptors and act simultaneously as A2A receptor antagonists and as D2 receptor agonists.

Η παρούσα εργασία αφορά στη μελέτη της ανταγωνιστικής αλληλεπίδρασης των A1/D1 υποδοχέων στο επίπεδο έκφρασης του πρωίμου γονίδιου zif/268 (δείκτης νευρωνικής δραστηριότητας) και της in vivo μεταγωγής σήματος των Α1 και Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση στο μυ weaver. Ο μυς weaver αποτελεί ένα γενετικό μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης η οποία συμβαίνει σταδιακά έτσι ώστε το μοντέλο αυτό να προσομοιάζει τη νόσο Πάρκινσον στον άνθρωπο. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης προέκυψε το ενδιαφέρον αποτέλεσμα ότι με την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των Α1 και D1 υποδοχέων παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ανταγωνιστική αλληλεπίδραση (ενδεχομένως μέσω σχηματισμού του ετεροδιμερούς) ενώ με την ενεργοποίηση μόνο των Α1 υποδοχέων στους weaver μύες παρατηρήθηκε αυξημένη ενεργοποίηση των νευρώνων του ραβδωτού σώματος και συγκεκριμένων περιοχών του εγκεφαλικού φλοιού. Η ενεργοποίηση αυτή ήταν μη αναμενόμενη δεδομένου ότι οι Α1 υποδοχείς (A1Rs) είναι συζευγμένοι με Gi πρωτεΐνες και καταστέλλουν τη μεταγωγή σήματος που οδηγεί στην επαγωγή του zif/268 μέσω του D1R/Gs/cAMP/PKA/pDARPP 32/pCREB μονοπατιού. Η ακόλουθη διερεύνηση του μηχανισμού έδειξε ότι η A1R επαγόμενη ενεργοποίηση του zif/268 καταστέλλεται από τον ειδικό ανταγωνιστή των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης (A2ARs) ΖΜ241385 και από τον ειδικό αγωνιστή των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης Quinpirole υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση των A2ARs και άρα ενεργοποίηση της έμμεσης οδού. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε δεδομένου ότι η διέγερση των A1Rs προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του mRNA της εγκεφαλίνης άλλα όχι της δυνορφίνης που αποτελούν δείκτες ενεργοποίησης της έμμεσης και της άμεσης οδού αντίστοιχα. Το γεγονός ότι ο αγωνιστής των Α1Rs δεν προκαλεί στα φυσιολογικά ζώα ενεργοποίηση του zif/268 mRNA υποδεικνύει την υπερευαίσθητη απόκριση των A2ARs. Η μελέτη της υπερευαίσθητης αυτής απόκρισης στο μυ weaver έγινε με τη διερεύνηση της μεταγωγής σήματος μετά από in vivo ενεργοποίηση των A2ARs α) του καθιερωμένου μονοπατιού A2ARs/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP 32/pCREB το οποίο οδηγεί στη επαγωγή του zif/268 και β) του μονοπατιού των ΜΑΡΚ. Τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης της DARPP 32 στη θέση Thr34. Τα αυξημένα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης DARPP 32 πολλαπλασιάζουν τη δράση της ΡΚΑ και άρα διευκολύνουν τη μεταγωγή σήματος μέσω A2ARs/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP 32/pCREB μονοπατιού. Επομένως η υπερευαίσθητη απόκριση των A2ARs κάτω από την έλλειψη ντοπαμίνης στο μυ weaver φαίνεται να οφείλεται στα αυξημένα ενδογενή επίπεδα της φωσφορυλιωμένης DARPP 32. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών ERK1/2(MAPK44/42) είναι αυξημένα στον μυ weaver άλλα μειώνονται σημαντικά μετά από την ενεργοποίηση των A2ARs. Δεν γνωρίζουμε το μηχανισμό μέσω του οποίου αυξάνονται τα ενδογενή επίπεδα των ERK1/2 και πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Το συμπέρασμα όμως που εξάγεται είναι ότι κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση η μεταβίβαση σήματος μέσω των A2ARs δεν ενεργοποιεί την οδό των MAP κινασών. Στην παρούσα in vivo μελέτη αναδεικνύεται ο ρόλος των Α1 και Α2Α υποδοχέων στην λειτουργία των βασικών γαγγλίων κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν ιδιαίτερη σημασία δεδομένου ότι εμφανίζονται σε ένα γενετικό μοντέλο παρκινσονισμού στο οποίο η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι σταδιακή και προσομοιάζει τη ΝΠ και όχι οξεία όπως σε άλλα τοξικά μοντέλα. Επιπλέον τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζουν ενδεχομένως κλινικό ενδιαφέρον δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της έμμεσης οδού μέσω A1Rs από την ενδογενή αδενοσίνη θα επιδείνωνε περαιτέρω τις κινητικές δυσλειτουργίες της ΝΠ. Η πληροφορία αυτή καθώς και η γνώση για την ενισχυμένη μεταγωγή σήματος μέσω των Α2Α υποδοχέων ενισχύουν την πρόταση για χρήση των Α2Α ανταγωνιστών ως αντιπαρκινσονικά φάρμακα. Δεδομένου ότι σήμερα το ενδιαφέρον είναι στραμμένο στη δημιουργία διμερών προσδεμάτων (bivalent ligands) που μπορούν να δρουν ταυτόχρονα σε δυο υποδοχείς η συγκεκριμένη πληροφορία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μελλοντική δημιουργία φαρμακευτικού σχήματος που να δρα ταυτόχρονα ως αγωνιστής των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης και ως ανταγωνιστής των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης.