Μελέτη κλωνικότητας σε ασθενείς με χρόνια λεμφική λευχαιμία και συσχέτιση με κλινικά και βιολογικά δεδομένα

Abstract

The monoclonal lg expressed from B CLL was originally considered identical in all leukemic cells. Recently, it has been demonstrated that a considerable subset of CLL patients (>50%) displays intraclonal diversification in their monoclonal Ig sequence, suggesting that the mechanism of ongoing somatic mutations is retained in a proportion of B CLL cells. The reasons leading to intraclonal diversification remain obscure. The complexity of studying this phenomenon relies on the enclaved risk of misinterpreting superimposed mutations originating from experimental artifacts. Moreover, the frequency and developmental pattern of intraclonal diversification in disease compartments other than blood (marrow and lymph nodes) are unknown. In order to clarify these issues, a total of 648 clones from 9 B CLL patients were analyzed. DNA was extracted from blood only in 3 of the patients (1st group: pt. 1-3) and from blood, marrow, lymph nodes and spleen in 6 patients (2nd group: pt. 4-9). Samples from various disease compartments were obtained from the patients at the same time in order to avoid any time related changes among leukemic clones. PCR was performed with leader/FR1 VH family specific primers and a consensus JH primer. Forty cycles of amplification with Taq platinum polymerase were used and monoclonal PCR products were ligated to TOPO TA vector. 13 to 60 insert containing clones were sequenced from both orientations. Polymerase mediated error was calculated by amplification for 40 cycles of a plasmid containing a PCR Ig insert, followed by cloning of the amplified PCR product and sequencing of 26 clones from both orientations. Polymerase mediated base error was calculated at 4.4x10⁻⁴ after 40 cycles of amplification. Experiments were repeated twice from the same DNA, to compare the sequences obtained from the 1st and 2nd experiment and set the standards for assigning true diversification. Base differences that were found to be represented in two or more clones out of 20 clones in a patient were found again when the experiment was repeated. Therefore these base differences were assigned as true intraclonal diversification. This was observed in 6 out of 9 patients (66.6%) (pt. 1, 3, 4, 5, 7, 8). Patient 3 was mutated while pt. 4, 5, 6, 7, 8 and 9 were unmutated in their Ig sequences. Only pt. 2 had two different clones, one mutated and one unmutated. Patients 4, 5, 7 and 8, displayed intraclonal diversification in some or in all disease compartments. Base point mutations in all analyzed clones that were unique in only one of the clones examined were observed at the polymerase mediated error rate. Unique base substitutions observed in an experiment were not identified again in a second independed experiment with the same DNA as template and therefore they were assigned as polymerase errors. Pt. 4 had ID only in blood, in 6/29 seq. (20.68%). Two sequences (seq.) out of these six seq. had an additional mutation and therefore represented evolutionary clones. The 22 marrow seq. and the 26 spleen seq. did not reveal diversifying mutations. Patient 5 displayed ID only in blood (2/26, 7.69%) but not in marrow (27 sequences). Patient 7 had ID only in marrow (2/49, 4.08%) and not in blood (67 sequences) or lymph node (49 sequences). Patient 8 had diversified clones in blood, marrow and lymph node, with a distinct pattern between the various compartments: in blood (57 clones) 5 different patterns of diversification were observed (56 out of 57 98.24%). Marrow sequences were all diversified and exhibited 6 patterns of diversification. Among them, there were the 5 blood patterns as well as an additional new one. In the lymph node clones, the marrow diversification motif was retained but one of the six patterns it was different than marrow. In all analyzed sequences (blood, marrow, lymph node) evolving clones could be identified. The diversified bases displayed a 2.875:1 R/S ratio while the pattern of mutations favored transitions over transvertions (3.42:1). Among the 31 diversified bases, 9 belonged to hot spot motifs (29.03%). The mutational processes targeted FRs rather than CDRs (mostly the FR1 regions FR1: FR3, 2.1:1). In conclusion, intraclonal diversification in one or more bases in a given Ig sequence must be considered true if identical base substitutions are observed in two or more clones in a patient (provided at least 15 clones are sequenced). Although the mechanisms of diversification remain largely unknown, it seems that patterns and frequency are not identical in B CLL cells from different diseases compartments (blood/marrow/lymph nodes/spleen). These differences may emerge from CLL cell/tissue interactions. Absence of Ig diversification in blood derived CLL cells does not rule out diversification presence in marrow or lymph node derived B CLL cells. Preference of FRs v CDRs substitutions implies that diversification process is not antigen driven. The presence of a functional mechanism of ongoing somatic mutations in leukemic clones and the ability of diversification to target with altered frequency/patterns various disease compartments implies a role of tissue millieu in CLL clone evolution.

Μέχρι πρότεινος η άποψη που επικρατούσε ήταν ότι η μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη που εκφράζουν τα κύτταρα της Β χρονίας λεμφογενούς λευχαιμίας (ΧΑΛ) είναι πανομοιότυπη σε όλα τα κύτταρα του κλώνου. Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι >50% των ασθενών με Β ΧΛΛ εμφανίζουν διαφοροποίηση στην αλληλουχία της μονοκλωνικής lg ανοσοσφαιρίνης τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός των συνεχιζόμενων σωματικών μεταλλάξεων διατηρείται ενεργός σε κάποια ΧΛΛ λεμφοκύτταρα. Η μελέτη αυτού του φαινομένου εσωκλείει κίνδυνο πειραματικών artifacts. Επίσης άγνωστα παραμένουν η συχνότητα εμφάνισης της ΕΔ και ο τρόπος ανάπτυξής της, πλην του αίματος, στον μυελό και τους λεμφαδένες. Προκειμένου να απαντηθούν κάποια από αυτά τα ερωτήματα, αναλύθηκαν συνολικά 648 αλληλουχίες ανοσοσφαιρίνης από 9 ασθενείς με ΧΛΛ. Έγινε απομόνωση γενωμικού DNA από το αίμα 3 ασθενών (1η ομάδα: ασθ. 1-3) και από το αίμα, τον μυελό, τους λεμφαδένες και τον σπλήνα από 6 ασθενείς (2η ομάδα: ασθ. 4-9). Τα δείγματα αίματος, μυελού, λεμφαδένων και σπληνός της 2ης ομάδας ελήφθησαν από τους ασθενείς την ίδια χρονική στιγμή με σκοπό αποφυγή τυχόν επιπρόσθετων μεταλλάξεων με την πάροδο του χρόνου. Έγινε PCR για 40 κύκλους με Taq platinum πολυμεράση και εκκινητές leader ή FR1 για τις 6 οικογένειες των ανοσοσφαιρινών (VH1-6) και έναν κοινό JH εκκινητή. Ακολούθησε σύζευξη των μονοκλωνικών PCR προϊόντων στον ΤΑ βέκτορα και 13-60 κλώνοι αναλύθηκαν ως προς την αλληλουχία των βάσεων τους και προς τις δύο κατευθύνσεις. Το ποσοστό λάθους της πολυμεράσης υπολογίστηκε σε 4.4x10⁻⁴ μετά από 40 κύκλους. Οι μεταλλάξεις των βάσεων που παρατηρήθηκαν σε δύο ή περισσότερες αλληλουχίες 20 κλώνων, επιβεβαιώθηκαν όταν το πείραμα επαναλήφθηκε από την αρχή και επομένως καθορίστηκε ότι αντιπροσωπεύουν αληθή ενδοκλωνική διαφοροποίηση. Με βάση τον ορισμό αυτό, ενδοκλωνική διαφοροποίηση παρατηρήθηκε σε 6 από τους 9 ασθενείς (66.6%) (ασθ. 1, 3, 4, 5, 7, 8,). Ο ασθ. 3 εμφάνιζε σωματικές υπερμεταλλάξεις (ΣΥ) στα γονίδια της βαρειάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης, ο ασθ.2 είχε δύο διαφορετικούς κλώνους (έναν με ΣΥ και έναν χωρίς) ενώ οι υπόλοιποι (ασθ. 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9) ήταν αμετάλλακτοι. Οι ασθ. 4, 5, 7 και 8 της 2ης ομάδας εμφάνισαν ενδοκλωνική διαφοροποίηση σε κάποιο ή όλα τα διαμερίσματα νόσου (αίμα/λεμφαδένα/μυελό/σπλήνα) που αναλύθηκαν. Το ποσοστό των σημειακών μεταλλάξεων βάσεων που παρατηρήθηκαν σε έναν μόνο κλώνο βρέθηκε κοντά στο ποσοστό του λάθους της πολυμεράσης και δεν επιβεβαιώθηκαν σε δεύτερο ανεξάρτητο πείραμα. Ο ασθ. 4 εμφάνιζε ΕΔ μόνο στο αίμα σε 6 από 29 αλληλουχίες (20.68%), δύο από τις οποίες μάλιστα έχοντας και δεύτερη μετάλλαξη διαφοροποίησης, αποτελούσαν εξελικτικούς κλώνους. Οι 22 αναλυθείσες αλληλουχίες του μυελού και οι αντίστοιχες 26 του σπλήνα στον ασθενή αυτό δεν ανέδειξαν ΕΔ. Στον ασθ. 5, ΕΔ υπήρχε μόνο στους κλώνους του αίματος (2/26, 7.69%) αλλά όχι στους 27 κλώνους του μυελού. Στον ασθ. 7 ΕΔ υπήρχε μόνο στον μυελό (2/49, 4.08%) και όχι στους 67 αναλυθέντες κλώνους του αίματος και τους αντίστοιχους 49 του λεμφαδένος. Ο ασθ. 8 εμφάνιζε ΕΔ στο αίμα, τον μυελό και τον λεμφαδένα αλλά με διακριτό πρότυπο ανάπτυξης: στο αίμα παρατηρήθηκαν 5 διαφορετικοί τύποι διαφοροποίησης σε 56 από 57 κλώνους (98.24%). Στον μυελό, και οι 64 αλληλουχίες είχαν ΕΔ με πρότυπο ανάπτυξης που ακολουθούσε αυτό του αίματος αλλά εμφάνιζε έναν επιπλέον νέο τύπο διαφοροποίησης. Στο δείγμα του λεμφαδένα διατηρήθηκε το βασικό πρότυπο διαφοροποίησης του μυελού αλλά με μία νέα θέση ΕΔ. Και στα τρία δείγματα (αίμα, μυελό, λεμφαδένα) ήταν δυνατή η αναγνώριση εξελικτικών κλώνων. Στις μεταλλάξεις ΕΔ, η αναλογία μεταλλάξεων μετάβασης : μεταστροφής ήταν 24:7 (3.42:1) και η αναλογία μεταλλάξεων αντικατάστασης προς σιωπηλών ήταν 23:8 (2.875:1). Από τις 31 συνολικά θέσεις ΕΔ, οι 9 (29.03%) συνιστούσαν μοτίβα θερμού σημείου σωματικών μεταλλάξεων. Όλες οι μεταλλάξεις ΕΔ στόχευαν τα FR τμήματα της βαρειάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης με το μεγαλύτερο ποσοστό τους στις FR1 περιοχές (FR1: FR3, 2.1:1). Συμπερασματικά, ΕΔ υφίσταται μόνο εάν πανομοιότυπες αντικαταστάσεις βάσεων παρατηρούνται σε δύο τουλάχιστον κλώνους. Ο τύπος και η συχνότητα διαφοροποίησης είναι δυνατό να διαφέρουν μεταξύ των ΧΑΛ κυττάρων του αίματος, του μυελού και του λεμφαδένος ενός ασθενούς. Ο τύπος των μεταλλάξεων και η προτίμηση των FR παρά των CDR περιοχών της ανοσοσφαιρίνης υποδηλώνουν απουσία αντιγονικής διέγερσης. Η διατήρηση ενεργού μηχανισμού σωματικών μεταλλάξεων στα ΧΑΛ λεμφοκύτταρα και η δυνατότητα ανάπτυξης ΕΔ με διαφορετική συχνότητα και ανομοιογενή τύπο μεταξύ αίματος, μυελού και λεμφαδένων, υποδηλώνουν σημαντική επίδραση του μικροπεριβάλλοντος στην εξέλιξη του νεοπλασματικού κλώνου.