Ανάπτυξη μεθόδων μέτρησης των υποδοχέων οιστρογόνων ERβ1 και ERβ2 και αξιολόγηση τους ως δεικτών πρόγνωσης του καρκίνου του μαστού

Abstract

Estrogen action is primarily mediated by the two subtypes of estrogen receptor (ER), ERα and ERβ. There are at least five ERβ isoforms in humans, of which two, namely ERβ1 and ERβ2, are primarily expressed in breast tissue, with ERβ1 being the only isoform that is able to bind hormone with high affinity. While ERα is established since long ago as a marker of favorable breast cancer prognosis and response to hormone therapy, the clinical significance of ERβ1 and ERβ2 is not clear as yet. In addition, little is known about the role of ERβ1 and ERβ2 in benign hyperplastic lesions of the breast and, in particular, the breast cancer risk of these lesions. To study the role of ERβ1 and ERβ2 in breast cancer and benign breast lesions, we characterized a series of new monoclonal and polyclonal antibodies using cells transiently or stably trasnfected with ERα, ERβ1 or ERβ2, including e.g. clones of human embryonic kidney cells HEK-293 engineered to stably express ERα and ERβ1. Using antibodies characterized as most suitable for immunohistochemistry, we found that, compared to ERα and ΕRβ2, ERβ1 is more frequently expressed in hyperplastic (HUT) and non-invasive neoplastic lesions (ADH, DCIS) of human breast. We also found that, while the percentage of ERα-expressing cells increases progressively from HUT to ADH and DCIS, that of ERβ2-expressing cells decreases from normal breast to ADH. In addition, we found that expression of Ki-67 was associated with ERα positivity in HUT and inversely associated with ERβ2 positivity in DCIS. These findings are taken to indicate that ERβ2 expression is dynamically regulated during mammary carcinogenesis and that ERβ2 could have a protective role with respect to DCIS progression. In ERα-negative breast cancer, ERβ1(+) was detected in 66 out of 97 (68%) cases and ERβ2(+) in 65 out of 96 (68%) cases. Tumour grade was significantly higher in ERβ1-negative cases compared to positive cases, while ERβ2 expression was positively correlated with lymph node metastasis. We did not find any relation between ERβ1 expression and patient overall or disease free survival. In contrast, ERβ2 has emerged as the most important prognostic variable after tumour grade. Patients with ERα-negative breast carcinomas that overexpress ERβ2 had lower disease free survival, independent of the type of post-operative treatment.

Τα οιστρογόνα ασκούν τη δράση τους μέσω των υποδοχέων οιστρογόνων τύπου άλφα και βήτα (ERα και ERβ). Στον άνθρωπο υπάρχουν 5 τουλάχιστον ισομορφές του ERβ, εκ των οποίων στο μαστό εκφράζονται κυρίως δύο (ERβ1 και ERβ2), ενώ μόνο μια (ERβ1) μπορεί να προσδέσει 17β-οιστραδιόλη με υψηλή χημική συγγένεια. Ο ERα είναι καθιερωμένος δείκτης πρόγνωσης και πρόβλεψης ανταπόκρισης σε ορμονοθεραπεία του καρκίνου του μαστού. Η κλινική σημασία της έκφρασης των ERβ1 και ERβ2 στο καρκίνο του μαστού δεν έχει ακόμα διευκρινισθεί, ενώ ακόμη λιγότερο γνωστά είναι η έκφραση και ο ρόλος τους σε καλοήθεις υπερπλαστικές αλλοιώσεις του μαστού. Για τη μελέτη του ρόλου των ERβ1 και ERβ2 στο καρκίνο και στις καλοήθεις υπερπλαστικές αλλοιώσεις του μαστού, χαρακτηρίσαμε σειρά νέων μονοκλωνικών και πολυκλωνικών αντισωμάτων αξιοποιώντας συστήματα παροδικής και μόνιμης έκφρασης των ERα, ERβ1 και ERβ2 όπως π.χ. κλώνους ανθρώπινων εμβρυϊκών κυττάρων νεφρού ΗΕΚ-293 που παράξαμε για να εκφράζουν σταθερά τον ERα ή τον ERβ1. Αξιοποιώντας τα πλέον κατάλληλα από τα ως άνω καλά χαρακτηρισμένα αντισώματα διαπιστώσαμε ότι ο ΕRβ1 εκφράζεται συχνότερα από τους ERα και ΕRβ2 στις υπερπλαστικές (HUT) και μη διηθητικές νεοπλασματικές αλλοιώσεις (ADH, DCIS) του ανθρώπινου μαστού. Επίσης, διαπιστώσαμε ότι ενώ το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζει τον ERα αυξάνεται σταδιακά από την αλλοίωση HUT στην ADH και στο DCIS σε σχέση με το φυσιολογικό μαστό, αυτό του ERβ2 μειώνεται από το φυσιολογικό μαστό προς την ADH. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι ο ρυθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού συσχετίζεται σημαντικά με την υψηλή έκφραση του ERα στη HUT και τη χαμηλή έκφραση του ERβ2 στο DCIS. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ότι η έκφραση του ERβ2 ρυθμίζεται δυναμικά προϊούσης της προκαρκινικής εξαλλαγής του επιθηλίου και ότι μείωση της έκφρασης του ERβ2 στο DCIS μπορεί να υποδηλώνει αυξημένο κίνδυνο εξέλιξής του σε διηθητικό καρκίνωμα. Αναφορικά με τους ERβ1 και ERβ2 στον ERα-αρνητικό διηθητικό καρκίνωμα μαστού διαπιστώσαμε ότι θετική πυρηνική έκφραση του ERβ1 εντοπίστηκε στις 66 από τις 97 (68%) και του ERβ2 στις 65 από τις 96 (68%) περιπτώσεις. Ο βαθμός διαφοροποίησης του καρκινώματος ήταν σημαντικά υψηλότερος στις ERβ1-αρνητικές περιπτώσεις σε σχέση με τις θετικές, ενώ η έκφραση του ERβ2 συσχετίστηκε θετικά με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. Η έκφραση του ERβ1 δεν συσχετίζεται με τη συνολική ή την ελευθέρα νόσου επιβίωση. Αντίθετα, ο ERβ2 αναδείχθηκε ως ο πιο σημαντικός προγνωστικός δείκτης μετά το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου. Ασθενείς με ERα-αρνητικό καρκίνο του μαστού που υπερεκφράζουν τον ERβ2 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερη ελευθέρα νόσου επιβίωση, ανεξαρτήτως του τύπου μετεγχειρητικής θεραπείας.