Μελέτη νεφρικών κυττάρων μετά από επίδραση αμινογλυκοσιδών με ανοσοϊστοχημεία φωτονικής και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας

Abstract

Aminoglycosides are the most frequently used antibiotics worldwide in the treatment of Gram-negative bacterial infections. The main stumbling block to use them in everyday practice is nephrotoxicity. In our research we studied the effect of amikacin and amikacin plus N-Acetylcysteine on renal proximal tubule cells. Female rats, weighing 120 gr ± 15 gr aged six weeks, were divided into three groups: a = group of normal saline, b = rats that were injected amikacin 15mg/kg for 14 days intraperitoneally (i.p.) and c = rats that were injected amikacin 15mg/kg plus N-Acetylcysteine 35 mg/kg for 14 days i.p.. The injection was always the same time, to avoid the consequences of the known variations of the normal daily rates. The number of animals in each experiment, and the number of repetitions was such as to permit reliable statistical analysis. The study protocol was as follows: 1. Measurements of creatinine and urea nitrogen in the blood serum. 2. Examination of renal tissue in light and electron microscope. Results received from all methods which are regarded as important because for the first time proving the difference between the measurements and the fine structure and functionality of proximal tubule cells. From the experiments we feel that the deterioration of cells depended on the life stage of the cells at the time of impact of amikacin and N-Acetylcysteine. This is illustrated by the fact that there are not enough cells with molecular damage, while others change their timeless program. Such changes should reflect the changes observed in measurements of creatinine and urea nitrogen, and the fine molecular structure, even in basic and acidic cell protein of renal parenchyma we observed. Finally, for the first time compares the measurement of creatinine and urea nitrogen with molecular findings and determine the structural, functional effect of N-Acetylcysteine corresponding of amikacin nephrotoxicity. The N-Acetylcysteine caused normalization of biochemical parameters proved by histology examination. These results suggest that N-Acetylcysteine has protective affects on amikacin-mediated nephropathy.

Στα πειράματά μας μελετήσαμε την επίδραση της αμικασίνης και αμικασίνης με Ν-ακετυλοκυστεΐνη στα κύτταρα των εγγύς εσπειραμένων σωληναρίων από νεφρικό παρέγχυμα πειραματόζωων. Ως πειραματόζωα, χρησιμοποιήσαμε επίμυες θηλυκούς, βάρους 120 gr ± 15 gr ηλικίας έξη εβδομάδων. O τρόπος χορήγησης των ουσιών (φυσιολογικός ορός, αμικασίνη, και αμικασίνη με Ν-ακετυλοκυστείνη) ήταν μία ενδοπεριτοναϊκή ένεση την ημέρα. Η ένεση αυτή γινόταν πάντα την ίδια ώρα, ώστε να αποφευχθούν οι συνέπειες από τις γνωστές, ημερήσιες διακυμάνσεις των φυσιολογικών ρυθμών. Ο αριθμός των πειραματόζωων σε κάθε πείραμα, καθώς και ο αριθμός των επαναλήψεων ήταν τέτοιος ώστε να επιτρέπει αξιόπιστη στατιστική επεξεργασία. Τους επίμυες τους χωρίσαμε σε τρεις ομάδες: α oμάδα -μάρτυρες, β oμάδα -πειραματόζωα που τους έχει χορηγηθεί αμικασίνη (amikacin) για 14 ημέρες και γ ομάδα -πειραματόζωα που τους έχει χορηγηθεί αμικασίνη και Ν-ακετυλοκυστείνη (N-acetylcysteine) για 14 ημέρες. Μεθοδολογία μελέτης των εγγύς εσπειραμένων σωληναρίων του νεφρικού παρεγχύματος μετά από επίδραση αμικασίνης και αμικασίνης με Ν-ακετυλοκυστεΐνη όλων των ομάδων έχει ως ακολούθως: 1. Εκτίμηση νεφρικής λειτουργίας πειραματόζωων μετρώντας τις τιμές κρεατινίνης και αζώτου ουρίας από τον ορό αίματος. 2. Μεθοδολογίες φωτονίου και ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Τα αποτελέσματα που λάβαμε από όλες τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιήσαμε αξιολογούνται ως σημαντικά, καθώς για πρώτη φορά αποδεικνύεται η διαφορά μεταξύ των μετρήσεων και των δεδομένων της λεπτής τους δομής και της λειτουργικότητας των κυττάρων από εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια του νεφρικού παρεγχύματος. Από τα πειράματά μας φαίνεται ότι οι αλλοιώσεις των κυττάρων εξαρτώνται και από τη φάση που βρίσκονται τα κύτταρα τη στιγμή της επίδρασης της αμικασίνης ή της αμικασίνης με Ν ακέτυλοκυστεΐνης και της μονιμοποίησής τους. Αυτό φαίνεται από το γεγονός ότι αρκετά κύτταρα δεν υφίστανται κυτταρικές ή μοριακές αλλοιώσεις, ενώ σε άλλα μεταβάλλεται το διαχρονικό τους πρόγραμμα. Τέτοιες μεταβολές πρέπει να εκφράζουν οι διαβαθμίσεις των μετρήσεων που παρατηρούνται στις τιμές κρεατινίνης του αζώτου ουρίας, σε σχέση με τις βασικές και όξινες πρωτεΐνες καθώς και τον πλεκτονομικό σχηματισμό των πυρήνων από κύτταρα του νεφρικού παρεγχύματος που παρατηρήσαμε. Τέλος για πρώτη φορά γίνεται σύγκριση των τιμών της κρεατινίνης και αζώτου ουρίας με μοριακά και ιστοχημικά ευρήματα για να διαπιστωθεί λειτουργική και βιοσυνθετική επίδραση της Ν-ακετυλοκυστεΐνης, όπως και η αντίστοιχη νεφροτοξικότητα της αμικασίνης. Οι τιμές της κρεατινίνης και αζώτου που λάβαμε στις επτά ημέρες, δεν εκφράζουν την ακριβή μεταβολή σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο που έχουν υποστεί τα κύτταρα των εγγύς εσπειραμένων σωληναρίων του νεφρικού παρεγχύματος από την επίδραση αμικασίνης και αμικασίνης με τη Ν ακετυλοκυστεΐνης. Αυτό φαίνεται από τα αποτελέσματα επίδρασης των παραπάνω ουσιών στις επτά ημέρες του προπειράματος, στο οποίο παρατηρήσαμε ότι η αύξηση των τιμών της νεφρικής λειτουργίας δεν εκφράζουν αλλοιώσεις σε ιστόνες ή ακόμη και στον πλεκτονομικό σχηματισμό των πυρήνων από κύτταρα των εγγύς εσπειραμένων σωληναρίων. Αυτό πιθανόν να σημαίνει ότι αν και η νεφρική ανεπάρκεια έχει αρχίσει να εγκαθίσταται, οι τιμές των μετρήσεων είναι αυξημένες, ωστόσο η έκφρασή τους σε επίπεδο ιστονών ή πλεκτονομικού σχηματισμού δεν παρατηρήσαμε να έχει εκφραστεί.