Engineering yeast for the production of plant terpenoids and characterization of their biosynthetic enzymes from Salvia sp.: arabidopsis plants overexpressing select antioxidant genes exhibit resistance to oxidative stress and bacterial infection

Abstract

Plants produce an enormous variety of low molecular weight compounds called secondary metabolites, through various biosynthetic pathways. Terpenoids and isoprenoids contribute more than 50,000 compounds to this chemical diversity which include numerous commercial flavors, fragrances and medicines. Artemisinin and taxol are such terpene-based drug compounds. In general, most useful terpenoids are produced in small quantities in plants, which has slowed considerably their commercial utilization. Research has recently targeted the development of microbial fermentative processes as an alternative approach. Saccharomyces cerevisiae is an amenable organism for metabolic engineering and the diversion of the metabolic machinery towards the overproduction of terpenoids compounds. Terpene synthases, the enzymes synthesizing terpenes utilize geranyl pyrophosphate (GPP), farnesyl pyrophosphate (FPP) or geranyl-geranyl pyrophosphate (GGPP) as substrates. In yeast they are synthesized by the sterol biosynthetic pathway. Although, the whole genetic pathway is present in yeast, it is tightly regulated and the precursors are present in limited quantities. To overcome this problem, a yeast strain producing high sterol levels was identified and tested for its capacity to produce a monoterpene cineole. This was achieved by stable transformation of a plasmid carrying the cineole synthase gene, a monoterpene synthase from Salvia fruticosa, under the control of an inducible promoter, and facile detection of the terpene products as volatiles by Head Space - Solid Phase Microextraction (HS-SPME) coupled with Gas Chromatography/ Mass Spectrometry (GC/MS) analysis. The selected strain was targeted for further modifications. A mutant stabilized version (K6R) of HMG2 under the control of the inducible Galactose promoter was stably integrated into the HO locus to generate strain AM63. The modified strain produces on average 1.5 fold more cineole than the parental strain and exhibited reduced background volatile metabolites when transformed with Sf-CinSyn (RC). Further molecular engineering of AM63 yeast strain aimed to maximize terpene productivity without sacrificing cell viability which could hamper the biofermentation process. Two different modifications targeted the upregulation of FPP synthase encoded by ERG20 gene by GAL promoter integration into the yeast chromosome of AM68 strain, and deletion of one allele of erg9 gene encoding for a squalene synthase in the diploid AM70 strain resulting in further enhancement in terpene production. AM68 strains produces 3 fold more cineole, while AM70 cells produced 3.5 fold more sesquiterpenes than the parental strain. Additional modifications targeted the HMG1 gene by truncation of the N-terminus and expression of the one allele under a stable constitutive promoter. The increased yield of terpenes in yeast enabled the identification of several novel terpene synthases isolated from Salvia fruticosa (Greek sage) and Salvia pomifera. Four of them failed to yield any products when tested as bacterially expressed proteins. One clone was a monoterpene synthase producing mostly cineole, distinct from the previously identified canonical Salvia cineole synthase, while another one was a naturally truncated form which failed to yield any products. The two other genes encoded for sesquiterpene synthases, the first producing beta-farnesene and nerolidol and the second was a multiproduct enzyme synthesizing alpha-cubebene, alpha-copaene, trans-caryophyllene and delta-cadinene. Focusing on the terpene synthase molecule we tested whether additional modifications in the N-terminus of CS in the chloroplastic targeting sequence could further enhance product yield. The truncated SfCinS1(RR) and SfCinS1(RC) catalyzed the formation of multiple monoterpenes using the endogenous GPP pool as substrate with a significant peak of 1,8-cineole. However, SfCinS1(RC) was found to be more stable, efficient, with high activity during long incubation times. Additionally, using the two-hybrid system we screened a Salvia fruticosa glandular trichome library to identify interacting proteins to the Cineole monoterpene synthase. One of the interactors an, HSP90 when co-expressed with cineole synthase (CS) reproducibly increased product yield by 20%. Parallel work in the context of the PENED funded project requirements focused on the in vivo characterization of two recently isolated enzymes involved in secondary metabolism and plant defense by expressing them in Arabidopsis transgenic plants. When exposed to acrolein-induced oxidative stress Arabidopsis plants overexpressing a thioredoxin-peroxidase transgene, LeTpx1, exhibited less sensitivity than wild type plants. Correspondingly, the BI-GST, a plant GST-like protein inhibiting Bax lethality in yeast cells, and the LeTpx1 transgenes significantly increased plant resistance to the microbial pathogen, Pseudomonas syringe pv.tomato DC3000.

Μια σημαντική κατηγορία φυσικών προϊόντων, τα τερπενοϊδή και ισοπρενοϊδή συνισφέρουν περισσότερες απο 50,000 ουσίες στην χημική ποικιλότητα των φυτών. Πολλά τερπένια έχουν προσελκύσει εμπορικό ενδιαφέρον για τις βιομηχανικές και ιατρικές τους χρήσεις. Ένα σημαντικό εμπόδιο στην επέκταση της χρήσης τους, είναι οι περιορισμένες ποσότητες που παράγουν τα φυτά. Ο Saccharomyces cerevisiae είναι οργανισμός που επιτρέπει την μεταβολική μηχανική με στόχο την παραγωγή φυτικών τερπενών. Οι συνθάσες τερπενίων είναι τα ένζυμα που συνθέτουν τερπένια αξιοποιώντας το διφωσφοπικό γερανύλιο (GPP), το διφωσφορικό φαρνεσύλιο (FPP) ή το διφωσφορικό γερανυλ-γερανύλιο (GGPP) ως υποστρώματα. Στη ζύμη συνθέτονται από το μονοπάτι βιοσύνθεσης στερολών. Ένα στέλεχος ζύμης που βρέθηκε να παράγει υψηλές στερόλες χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω τροποποιήσεις. Ένα μετάλλαγμα του γονιδίου HMG2 (K6R), με αυξημένη σταθερότητα, ενσωματώθηκε στο ΗΟ τόπο του γονιδιώματος κάτω από τον έλεγχο του επαγώμενου εκκινητή γαλακτόζης (στέλεχος ΑΜ63). Μια σειρά χαρακτηρισμένων και νέων συνθασών τερπενίων που απομονώθηκαν απο τή Salvia fruticosa (φασκόμηλο) εκφράστηκαν στο στέλεχος ΑΜ63 και το πατρικό του. Το τροποποιημένο στέλεχος παράγει κατά μέσο όρο 1,5 φορές περισσότερο από το πατρικό του και εκλύει μειωμένους πτητικούς μη-ειδικούς μεταβολίτες. Αυτό επιτρέπει τον χαρακτηρισμό τριών νέων συνθασών τερπενίων που στο παρελθόν δεν είχαν καταλυτική δράση όταν εκφράστηκαν ως βακτηριακές πρωτεΐνες. Μία απο αυτές ήταν μια συνθάση μονοτερπενίων που παράγει κύρια σινεόλη, αλλά διαφέρει απο την ορθόλογη συνθάση σινεόλης. Δύο άλλες κωδικοποιούν για σεσκιτερπενικές συνθάσες, η πρώτη παράγει β-φαρνεσίνη και νερολιδόλη ενώ ή δεύτερη δ-καδινένιο, α-κουμπεμπένιο, α-κοπαένιο και trans-καρυοφυλένιο. Περαιτέρω μοριακή μηχανική του στελέχους ΑΜ63 στόχευσε στη μεγιστοποίηση της παραγωγικότητας σε τερπένια χωρίς να θυσιαστεί η βιωσιμότητα του οργανισμού κατά την διαδικασία της βιοζύμωσης. Δύο διαφορετικές τροποποιήσεις στόχευσαν στην υπερέκφραση της FPP συνθάσης που κωδικοποιείται από το γονίδιο ERG20 με ενσωμάτωση του GAL εκκινητή στο χρωμόσωμα του ΑΜ68 στελέχους και την αδρανοποίηση ενός αλληλόμορφου του erg9 που κωδικοποιεί την συνθάση σκουαλενίου (στέλεχος ΑΜ70) με αποτέλεσμα την περαιτέρω αυξημένη παραγωγή τερπενίων. Το ΑΜ68 παράγει 3 φορές περισσότερη σινεόλη, ενώ το ΑΜ70 παράγει 3,5 φορές περισσότερα σεσκιτερπένια από το πατρικό τους. Περαιτέρω τροποποιήσεις στόχευσαν το HMG1 γονίδιο αποκόπτωντας το Ν-terminus και υπερεκφράζοντας το αλληλόμορφο με ισχυρό σταθερό εκκινητή. Εστιάζοντας στην μονοτερπενική συνθάση ελέγξαμε κατά πόσο οι περαιτέρω τροποποιήσεις στο Ν-τελικό άκρο της ΣΣ στις αλληλουχίες χλωροπλαστικής στόχευσης μπορούν να επιρέασουν περαιτέρω την παραγωγή. Επιπρόσθετα χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη δύο υβριδίων απομονώσαμε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τη συνθάση σινεόλης. Μια από αυτές η HSP90 οταν εκφράζεται μαζί με την συνθάση σινεόλης οδηγεί σε αύξηση της παραγωγής κατα 30%. Παράλληλη δουλειά στα πλαίσια των απαιτήσεων του προγράμματος ΠΕΝΕΔ εστιάστηκε στον in-vivo χαρακτηρισμό δύο πρόσφατα απομονωθέντων ενζύμων που συμμετέχουν στο δευτερογενή μεταβολισμό και την άμυνα, σε φυτά Arabidopsis. Έκθεση στην ακρολεΐνη επάγει οξειδωτικό στρές. Τα φυτά Arabidopsis που υπερεκφράζουν την υπεροξειδάση θειορεδοξίνης LeTPX1 παρουσίασαν μικρότερη ευαισθησία απο τα αγρίου τύπου φυτά. Αντίστοιχα η BI-GST μια τρανσφεράση της γλουταθειόνης και η LeTPX1 αύξησαν σημαντικά την φυτική αντοχή στον παθογόνο μικροοργανισμό Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000.